液質(zhì)聯(lián)用法監(jiān)測(cè)玉屏風(fēng)顆粒原藥材的投料分析研究

羅華玲，王小林，朱敏鳳，馮想，袁茂華，黎小虎，林海霞

(樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂山 614000)

玉屏風(fēng)為中醫(yī)扶正固表的傳統(tǒng)名方，其顆粒劑由黃芪、防風(fēng)、白術(shù)(炒)三味藥組成，具有益氣、固表、止汗之功效，主要用于表虛不固，自汗惡風(fēng)，面色晄白，或體虛易感風(fēng)邪者。玉屏風(fēng)顆粒為國家中藥保護(hù)品種，收載于《中國藥典》2015年版一部[1]。根據(jù)中醫(yī)藥理論及方解，中藥復(fù)方制劑是依據(jù)君臣佐使的原則組方給藥，其療效是各味藥綜合作用的體現(xiàn)。在本方中黃芪重用益氣固表，實(shí)衛(wèi)止汗，為君藥；白術(shù)健脾益氣，助黃芪益氣固表，為臣藥；防風(fēng)走表而御風(fēng)邪，為佐藥。玉屏風(fēng)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅以黃芪的主要有效成分黃芪甲苷作為質(zhì)量控制指標(biāo)，難以全面控制復(fù)方制劑的質(zhì)量。那么某些制藥廠為了提高自己市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，會(huì)降低其生產(chǎn)成本，利用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不完善，在生產(chǎn)中會(huì)少投或不投某些藥材，或直接加入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有質(zhì)控的有效成分，那么這些藥品，雖然沒有按生產(chǎn)工藝投料生產(chǎn)，擔(dān)按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)卻還是合格。這就造成質(zhì)量不同的玉屏風(fēng)顆粒價(jià)格高低不一，擾亂市場(chǎng)，同時(shí)也不能確保人民群眾用藥的安全性和有效性[2]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，國內(nèi)外對(duì)玉屏風(fēng)顆粒有效成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)的檢測(cè)方法報(bào)道并不多見，主要的測(cè)定方法有 RP-HPLC(反相高效液相色譜法)[3-4]、HPLC-ELSD(高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè))[5]、UV(紫外可見分光光度法)[6]、UPLC(超高效液相色譜法)[7]，但都僅以一、兩種有效成分作為監(jiān)測(cè)對(duì)象，未見有全面測(cè)定玉屏風(fēng)顆粒中各有效成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)含量的報(bào)道，更無應(yīng)用HPLC-MS/MS法全面監(jiān)測(cè)玉屏風(fēng)顆粒中原藥材(黃芪、防風(fēng)、白術(shù))投料情況的報(bào)道。

因此本實(shí)驗(yàn)從監(jiān)測(cè)制藥廠家生產(chǎn)的中成藥是否按工藝投料方面著手，以中成藥玉屏風(fēng)顆粒為研究對(duì)象，應(yīng)用HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，測(cè)得混合對(duì)照藥材(黃芪、防風(fēng)、白術(shù))、對(duì)照品(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)、市售玉屏風(fēng)顆粒樣品的一級(jí)質(zhì)譜圖及二級(jí)質(zhì)譜圖，選取各自的特征峰進(jìn)行對(duì)比分析，即可監(jiān)測(cè)玉屏風(fēng)顆粒中原藥材(黃芪、防風(fēng)、白術(shù))的投料情況；通過測(cè)得的HPLC-MS/MS色譜峰面積，可同時(shí)對(duì)質(zhì)控成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。該方法能更全面、快捷地監(jiān)控玉屏風(fēng)顆粒的投料情況及質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SIL-20AHT型高效液相色譜儀-API3200型質(zhì)譜儀(高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源，美國AB SCIEX公司)；數(shù)據(jù)處理軟件analyst Software(版本1.4.2Build1465，美國AB SCIEX公司)；電子天平(mettle toledo)；KQ-700DE數(shù)控超聲波清洗器(上海躍進(jìn)醫(yī)用光用器械廠)。

1.2 材料

黃芪甲苷(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110781-201616，純度：97.4%)；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)111978-201501，純度：99.9%)；升麻苷(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111522-201511，純度94.8%)；黃芪(蒙古黃芪，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120974-201311)；白術(shù)(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào) 120925-201109)；升麻(興安升麻，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121182-201102)；玉屏風(fēng)顆粒(市售藥品，廣東環(huán)球制藥有限公司，批號(hào)分別為 170101、160608、160318，規(guī)格為5g/袋×12袋/盒)。甲醇、乙醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱Inertsil ODS-3，(2.1 mm×150 mm×5 μm)；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；體積流量為0.2 mL/min；流動(dòng)相以甲醇(A)-10 mmol/L醋酸銨(B)溶液,梯度洗脫(0～3 min，5%A；3～4 min,5%～95%A； 4～10 min,95%A；10～15 min,95%～5%A；15.01 min,stop)。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧ESI離子源；掃描方式：負(fù)離子；檢測(cè)方式：多反應(yīng)定性(定量)監(jiān)測(cè)；負(fù)極電離；氣簾氣流速為30 L/min；碰撞氣流速為3 L/min；毛細(xì)管電壓為-5 500 V；干燥氣溫度為450℃；加熱電離輔助氣流速為30 L/min；加熱電離輔助氣流速為30 L/min；檢測(cè)器采用負(fù)離子檢測(cè)，掃描方式采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜、全掃描二級(jí)質(zhì)譜，質(zhì)荷比范圍100～1 000。黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷質(zhì)譜分析的條件參數(shù)見表1。

表1 黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷質(zhì)譜分析的條件參數(shù)

2.2 對(duì)照提取物及對(duì)照品溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取黃芪甲苷11.26 mg(含量以97.4%計(jì))，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得黃芪甲苷對(duì)照品溶液109.67 μg/mL；精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 10.45 mg(含量以99.9%計(jì))，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，得白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品溶液104.40 μg/mL；精密稱取升麻苷11.21 mg(含量以94.8%計(jì))，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，得升麻苷對(duì)照品溶液106.27 μg/mL。

混合對(duì)照品溶液：精密量取黃芪甲苷對(duì)照品溶液1 mL，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品溶液1 mL,升麻苷對(duì)照品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。黃芪甲苷對(duì)照品溶液濃度為1.10 μg/mL，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品溶液1.04 μg/mL，升麻苷對(duì)照品溶液1.06 μg/mL。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液的配制

精密稱取黃芪藥材3.045 1 g，加水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，濾過，濾液濃縮至適量，加乙醇至含醇量為70%，攪拌，靜置，濾過，濾液減壓濃縮至約1 mL，加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至200 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取此溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密稱取白術(shù)藥材1.041 9 g，加水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，濾過，濾液濃縮至適量，加乙醇至含醇量為70%，攪拌，靜置，濾過，濾液減壓濃縮至約1 mL，加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至200 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取此溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密稱取防風(fēng)藥材1.065 3 g，提取揮發(fā)油，蒸餾后水溶液濃縮至約1 mL，揮發(fā)油及濃縮水溶液置200 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度；精密量取此溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取玉屏風(fēng)顆粒，研成細(xì)粉，精密稱定約2.5 g，置索氏提取器中，加甲醇180 mL，加熱回流至提取液無色(約6 h)，提取液過濾至200 mL量瓶中，用甲醇多次洗滌藥粉，并入量瓶中，用甲醇定容至刻度；取上述溶液5 mL置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，即得。

按上述色譜及質(zhì)譜條件，將黃芪對(duì)照藥材、白術(shù)對(duì)照藥材、防風(fēng)對(duì)照藥材、玉屏風(fēng)顆粒、混合對(duì)照品(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷對(duì)照品)進(jìn)行測(cè)定，記錄一級(jí)質(zhì)譜圖(圖1、圖2)、HPLC-MS/MS色譜圖(圖3)。由圖1、圖2及圖3可知玉屏風(fēng)顆粒中各組分峰型良好，本方法具有較好的分離度和靈敏度，可以進(jìn)行定量分析。

注：A:黃芪對(duì)照藥材;B：白術(shù)對(duì)照藥材；C:防風(fēng)對(duì)照藥材;D:玉屏風(fēng)顆粒圖1 黃芪對(duì)照藥材,白術(shù)對(duì)照藥材,防風(fēng)對(duì)照藥材,玉屏風(fēng)顆粒的一級(jí)質(zhì)譜圖

注：E：黃芪甲苷 (785.8/143.5 amu)、F：白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(249.2/231.8 amu)、G：升麻苷(469.5/308.0 amu)圖2 混合對(duì)照品(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)一級(jí)質(zhì)譜圖

圖3 黃芪甲苷，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，升麻苷對(duì)照品的HPLC-MS/MS色譜圖

從對(duì)照品一級(jí)質(zhì)譜圖上可看出，黃芪甲苷的特征峰為785.8；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的特征峰為231.4、249.4；升麻苷的特征峰為469.5。黃芪對(duì)照藥材的特征峰為177.3、360.3、381.1、458.4、475.3、679.9、785.8；白術(shù)對(duì)照藥材的特征峰為135.4、161.4、163.8、185.7、231.7、249.9；防風(fēng)對(duì)照藥材的特征峰為266.2、291.4、307.4、453.4、469.4、491.3；混合對(duì)照品的特征峰為231.4、249.4、469.5、587.5、785.8。

在市售玉屏風(fēng)顆粒一級(jí)質(zhì)譜圖的特征峰：116.1、175.3、249.3、381.1、469.4、785.6，可以看到市售玉屏風(fēng)顆粒與黃芪對(duì)照藥材、白術(shù)對(duì)照藥材、防風(fēng)對(duì)照藥材、混合對(duì)照品(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷)的一級(jí)質(zhì)譜圖有相應(yīng)的特征峰，由此可判斷，市售玉屏風(fēng)顆粒按原藥材(黃芪、白術(shù)、防風(fēng))投料，即可確定該中成藥按生產(chǎn)工藝投料。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 專屬性

分別取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液與溶劑空白，采用HPLC-MS/MS法測(cè)定，供試品溶液總離子流色譜圖中待測(cè)峰的出峰位置處未見干擾峰，專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品溶液的制備：精密量取黃芪甲苷對(duì)照品溶液(109.67 μg/mL)(2.2項(xiàng))5 mL置50 mL棕色量瓶中，定容到刻度，取上述溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、6 mL置100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品溶液。照上述色譜、質(zhì)譜條件，分別吸取10 μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸，得線性回歸方程y=1.85e+004x-69.7(r=0.999 5)，結(jié)果表明在0.105～0.628 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

精密量取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品溶液(104.40 μg/mL)5 mL置50 mL棕色量瓶中，定容到刻度，取上述溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、6 mL置100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品溶液。照上述色譜、質(zhì)譜條件，分別吸取10μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸，得線性回歸方程y=1.74e+006x+1.36e+003(r=0.999 9)，結(jié)果表明在0.104～0.626 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

精密量取升麻苷對(duì)照品溶液(106.27 μg/mL)0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、3 mL置100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品溶液。照上述色譜、質(zhì)譜條件，分別吸取10 μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸，得線性回歸方程y=6.16e+004x+3.95e+003(r=0.998 8)，結(jié)果表明在0.531～3.19 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

2.4.3 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，照上述色譜、質(zhì)譜條件，分別吸取10 μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，按“2.1分析條件” ，平行測(cè)定6次，記錄色譜圖各對(duì)照品的峰面積，并計(jì)算得黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷色譜峰面積的RSD分別為0.56%，0.80%，1.10%。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)玉屏風(fēng)顆粒顆粒(批號(hào)為170101)6份，按“2.3”項(xiàng)方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1分析條件”測(cè)定3個(gè)有效成分峰面積，計(jì)算樣品中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷的含量，其含量的RSD分別為1.1%、0.9%、1.6%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取玉屏風(fēng)顆粒顆粒(批號(hào)為170101)1份，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1分析條件”測(cè)定，分別于 0，2，4，8，12，24 h進(jìn)行測(cè)定分析，以色譜峰面積計(jì)算，結(jié)果黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷峰面積的RSD分別為0.9%、1.2%、2.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定; 將同一供試品溶液置于4 ℃冰箱中，每日進(jìn)樣1次，連續(xù)測(cè)定5 d，以峰面積計(jì)算，結(jié)果黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷峰面積的RSD分別為1.8%、1.7%、2.5%。

2.4.6 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取黃芪甲苷12.05 mg(含量以97.4%計(jì))，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得黃芪甲苷對(duì)照品溶液1.173 7 mg/mL；精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ16.85 mg(含量以99.9%計(jì))，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，得白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品溶液0.673 3 mg/mL；精密稱取升麻苷26.73 mg(含量以94.8%計(jì))，置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，得升麻苷對(duì)照品溶液5.068 0 mg/mL。

取玉屏風(fēng)顆粒(批號(hào)為170101)9份，三份為一組，研成細(xì)粉，分別精密稱取約1.2 g，置索氏提取器中，每組分別精密加入上述黃芪甲苷對(duì)照品溶液(1.173 7 mg/mL)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品溶液(0.673 3 mg/mL)、升麻苷對(duì)照品(5.068 0 mg/mL)0.8 mL、1 mL、1.2 mL各三份；加甲醇180 mL，加熱回流至提取液無色，提取液過濾至200 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度；取上述溶液5 mL置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，即得。黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷平均回收率分別為90.77%，93.25%, 94.26%(n=9)。玉屏風(fēng)顆粒中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷回收率結(jié)果見表2。

2.5 樣品測(cè)定

取3批次玉屏風(fēng)顆粒(1.2項(xiàng))照(2.3項(xiàng))制備方法制備供試品溶液，按“2.1分析條件”測(cè)定三種有效成分的峰面積，每批重復(fù)測(cè)定 3 次，按回歸方程計(jì)算黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷的含量，結(jié)果見表3。

2015年版《中國藥典》規(guī)定每袋玉屏風(fēng)顆粒含黃芪以黃芪甲苷計(jì)，不得少于3.5 mg，未對(duì)其余兩成分作規(guī)定。根據(jù)表3結(jié)果，可知3批次樣品的黃芪甲苷含量符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

表2 玉屏風(fēng)顆粒中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 玉屏風(fēng)顆粒中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、升麻苷的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

玉屏風(fēng)顆粒是由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)制成的復(fù)方制劑，中藥復(fù)方是依據(jù)君臣佐使的原則組方給藥，中藥復(fù)方的療效是各味藥綜合作用的體現(xiàn)，本制劑中的主要藥效指標(biāo)成分為黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷，而《中國藥典》單以一味藥(黃芪)為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)來衡量，難以全面控制復(fù)方的質(zhì)量。本文應(yīng)用HPLC-MS/MS方法建立了同時(shí)檢測(cè)玉屏風(fēng)顆粒中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷的定量測(cè)定方法，流動(dòng)相以甲醇-10 mmol/L醋酸銨溶液按梯度程序洗脫，體積流量為0.4 mL/min，各成分得到較好的分離，且保留時(shí)間適當(dāng)。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS/MS方法監(jiān)測(cè)原藥材投料情況及同時(shí)測(cè)定主要藥效指標(biāo)成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷)的含量。本方法可同時(shí)進(jìn)行樣品前處理及各有效成分的含量測(cè)定，在人力物力上節(jié)約了時(shí)間和成本；且通過測(cè)得原藥材(黃芪、白術(shù)、防風(fēng))、主要藥效指標(biāo)成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷)、及市售玉屏風(fēng)顆粒的一級(jí)質(zhì)譜圖及二級(jí)質(zhì)譜圖，選取各自的特征峰進(jìn)行對(duì)比分析，可判斷該藥品生產(chǎn)時(shí)是否按工藝投料，即可全面監(jiān)測(cè)原藥材的投料情況；將樣品的色譜峰面積代入指標(biāo)成分(黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷)的線性方程中，可準(zhǔn)確計(jì)算出玉屏風(fēng)顆粒中有效指標(biāo)成分黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷的含量。

研究結(jié)果顯示：含量測(cè)定的方法學(xué)考察均符合要求，該方法成本低、快速簡(jiǎn)便、精密度好、科學(xué)合理、靈敏度高，可全面監(jiān)測(cè)和控制原藥材的投料情況，可準(zhǔn)確地測(cè)定出玉屏風(fēng)顆粒中黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和升麻苷的含量，并為含黃芪、白術(shù)、防風(fēng)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高研究提供參考依據(jù)；此方法不僅為玉屏風(fēng)顆粒的質(zhì)量控制提供了參考和依據(jù)，同時(shí)為下一步研究玉屏風(fēng)顆粒的藥動(dòng)學(xué)奠定了一定基礎(chǔ)。