表面等離子體諧振（SPR）技術在水稻堊白基因Chalk5 檢測中的應用

摘 要：以堊白度低的明恢63與堊白度高的9311的基因組DNA為材料設計探針，構建基于表面等離子體諧振（Surface Plasmon Resonance， SPR）技術的水稻堊白基因檢測方法，并用16個已知堊白度的水稻品種檢驗該方法的可靠性。結果表明：通過生物素修飾后單聯DNA片段探針與羧基傳感芯片上鏈霉親和素（SA）的結合構建基因芯片，再以100 μL 0.16 μmol/L的PCR產物與探針進行分子雜交，可獲得較好的SPR信號；以該方法獲得的SPR信號差值的絕對值與水稻堊白成正相關關系，可定性判斷水稻品種堊白度的高低；同時，SPR檢測方法無需標記，分析過程完全自動化，可實現水稻堊白基因的快速檢測。

關鍵詞：表面等離子體諧振（SPR）技術；水稻；堊白；Chalk5；基因芯片

中圖分類號：Q812 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）08-0001-04

Application of Surface Plasmon Resonance （SPR） Technique in Detection of Rice Chalk5 Gene

HUANG Wei-heng1， 2，WANG Xue-feng2， 3，XIN Ye-yun1， 2

（1. Hunan University ， Changsha 410012， PRC； 2. Hunan Hybrid Rice Research Center， Changsha 410125， PRC；

3. Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract： Using genomic DNA of Minghui 63 with low chalkiness and 9311 with high chalkiness as probes， a method based on Surface Plasmon Resonance （SPR） was developed to detect Chalkiness in rice， and its reliability was tested by 16 rice varieties with known chalkiness. The results showed that single DNA fragment probes modified by biotin combining with streptavidin （SA） on carboxyl sensing chip to construct gene chip， PCR products of rice （100 μL 0.16 μmol/L） were subjected to molecular hybridization and get a more better SPR signal value； The difference of SPR signal obtained by this method is positively correlated with rice chalkiness， and the chalkiness of rice varieties can be qualitatively judged； at the same time， the SPR method did not need markers， and the analysis process was completely automated， which can realize the rapid detection of rice chalkiness gene.

Key words： surface plasmon resonance； rice； grain chalkiness； Chalk5； gene chip

水稻是全世界重要的糧食作物之一。隨著我國經濟的高速發展以及人們生活水平的不斷提高，人們對水稻品質的要求也不斷提升。因此，選育品質優良的水稻新品種成為水稻育種重要目標之一。20世紀70年代開始我國大面積推廣雜交水稻，并開展了一系列稻米品質改良的研究，經過多年努力，我國在提高雜交水稻品質方面取得了較好的成果[1-2]。但某些米質性質如堊白度、堊白粒率等達標率仍不高[3-4]。

堊白是指稻米胚乳中組織疏松而形成的白色不透明部分，它極大地影響了稻米可食用性，是衡量水稻外觀品質的一個重要指標。堊白基因控制座位比較復雜，其中Chalk5是一個能顯著降低稻米堊白的主效基因[5]，Chalk5基因mRNA含量的不同，導致水稻堊白的含量差異；在一些品種中，堊白受Chalk8-1、Chalk8-2、Chalk8-3和Chalk10 等基因的控制；另外，還有影響堊白的一些微效基因起作用[5-8]。因此，建立快速、準確檢測堊白相關基因的方法是選育低堊白水稻品種的基礎。

表面等離子體諧振（SPR）技術是20世紀90年代發展起來的一種新技術。該技術應用SPR光學原理檢測生物傳感芯片（biosensor chip）上配位體與分析物之間的相互作用情況，廣泛應用于各個領域。SPR的基本原理為在玻璃棱鏡表面鍍了一層50 nm左右的金屬納米膜，光以不同的入射角射入納米膜層發生全反射并產生表面諧振現象。發生諧振時入射角是由金屬界面的折射率決定的，而金屬界面上生物分子的結合會改變此處的折射率，從而引起諧振角的改變，通過監測諧振角的變化，可以實時檢測芯片表面生物分子的結合與分離的狀態[9-11]。該技術無需標記、無需分離純化，可用于實時定量檢測固定在傳感芯片上組分[9]。基于SPR傳感器工作原理，通過生物薄膜技術、分子雜交技術等在生物表面基質層上包裹SA蛋白，就可對溶液中特定的生物分子進行檢測。

研究以米質好堊白度低的明恢63與米質差堊白度高的9311的基因組DNA為材料設計探針，構建基于SPR技術的水稻堊白基因檢測方法，并用16個已知堊白度的水稻品種檢測SPR方法的可靠性，以期建立一種高靈敏度、高準確性、快速檢測水稻堊白的方法，為提高水稻育種效率提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究所用的16個水稻品種（表1）均由湖南雜交水稻研究中心提供。基礎的SPR芯片、用于SA固定的溶液都是由北京華安麥科生物技術有限公司提供。SPR儀器為項目組共同研發。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻基因組DNA的提取及處理 采用常規的CTAB法[12]提取水稻基因組DNA，將提取的DNA溶解于50 μL ddH2O中，置于Nanodrop 2 000分光光度計檢測，取OD260/280值在1.7～2.0之間的DNA樣品作為PCR的模板，保存于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴增及擴增產物檢測 PCR反應體系（60 μL）：

2×Eco Taq PCR Super mix 30 μL，SSR引物（Chalk-F：

3'-CATCCAAATAGAGGAGCCAC-5'；Chalk-R：3'-TGAA

AAAGCCATAAAAAAGC-5'）3 μL，DNA模板為6 μL，dd

H2O 21 μL。反應程序：95℃預變性3 min，98℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸50 s，34個循環；72℃ 4 min，16℃保溫1 min。擴增產物經過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，保留擴增出條帶的PCR產物。

1.2.3 芯片探針的設計 參照陳忠等[13]的方法設計探針，采用單鏈DNA探針，長度為20～60 bp，5′端連接polyA，3′端進行生物素修飾（擎科生物公司合成）。水稻堊白基因Chalk5有多個基因位點跟水稻堊白相關聯，根據參考文獻[8]中9311和明恢63基因序列在啟動子979～991區間的缺失差異，設計單鏈DNA探針如表2所示。

1.2.4 鏈霉親和素（SA）的固定 將羧基修飾的SPR芯片IB-CM（華安麥科生物公司）安裝到SPR儀器上，取200 μL EDC（N-羥基琥珀酰亞胺）和NHS[1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽]的混合溶液（0.010 g NHS和0.050 g EDC共同溶于4 mL ddH2O）流經過芯片表面，反應20 min，活化羧基。然后，取200 μL 50 μg/mL的鏈霉親和素（SA）溶液（溶劑為0.01 mol/L以HCl調pH值為4.5的醋酸緩沖液溶）流經過芯片表面，反應20 min，將200 μL BSA溶液（1.0 mol以HCl調pH值為8.4的乙醇胺溶液）流經過芯片表面以封閉殘存的活性位點。

1.2.5 探針與芯片的連接 將修飾過的SPR芯片安裝到SPR儀器上，取100 μL 1.0 mol/L探針溶液以10 μL/min流速流過芯片表面，使探針連接到芯片表面。

1.2.6 PCR產物檢測濃度的選擇 將15×SSPE緩沖溶液、ddH2O、PCR待測產物（來自9311與空育131這2個品種）混合，配制100 μL濃度分別為0.25、0.16 μmol/L的溶液流經過芯片，反應10 min，以確定最適的PCR產物濃度。

1.2.7 基于SPR技術的水稻基因檢測及分析 根據上述確定的最適PCR產物濃度，取16 μL PCR產物、34 μL 15×SSPE緩沖溶液、50 μL ddH2O混勻，95℃加熱變性3 min，100 μL樣品上樣，在SPR儀上進行反應，反應倉溫度40℃，反應10 min，記錄SPR信號。根據SPR信號值結果，對水稻的米質堊白度進行分析。

2 結果與分析

2.1 PCR產物檢測濃度的選擇

由圖1可知，當9311與空育131的PCR產物濃度為0.25、0.16 μmol/L時都有結合信號，9311材料中，0.16 μmol/L濃度SPR信號比0.25 μmol/L濃度信號明顯增強；空育131材料中，0.25 μmol/L濃度SPR信號比0.16 μmol/L濃度信號微弱增強。相比較下9311材料在0.16 μmol/L濃度SPR信號更加強，故選擇PCR產物在0.16 μmol/L濃度時進行分子雜交。

2.2 分子雜交檢測結果與真實值的對比分析

試驗采用米質好堊白度低的明恢63與米質差堊白度高的9311的基因組DNA作為探針設計的基礎，故以9311與明恢63的SPR信號值為基準值，SPR儀器檢測信號值波動范圍為±20。根據表3中SPR信

3 結論與討論

研究中，采用羧基修飾的SPR芯片，選擇分子雜交濃度。由SPR信號值可知，在0.16 μmol/L濃度下，分子雜交信號值最大。這可能與探針的結合率有關系，加入100 μL 0.16 μmol/L的PCR產物足以達到探針的飽和度，提高探針與待測物的接觸率，增加兩者結合的概率，進而提高檢測的分辨率。

利用新建立的SPR法檢測16種水稻品系樣本，并且與已經公布的堊白度值進行比較。發現各品種與對照的SPR信號差值的絕對值與公布的堊白度值基本成正相關關系。

常規SPR檢測方法為直接SPR信號檢測法，即將一個分子固定在芯片上，當樣本流過芯片時，與芯片上的分子進行連接，再用清水洗掉沒有連接上的樣本，直接檢測所產生的信號值。直接檢測法可能會因背景不同等原因造成信號值不準確。研究中采用的是間接SPR檢測法，通過差值的絕對值，消除了背景的影響，使SPR信號表達更加準確。

與常規SPR檢測方法相比，該研究創新的SPR方法無需標記，直接通過分子結合就能夠產生足夠的SPR信號完成檢測，可實現水稻堊白的快速檢測，使分析更加簡便快捷。常規方法檢測一個品質大約需要一周的時間，而SPR方法完成一次檢測只需20 min左右，且樣品處理后，分析過程完全自動化，能避免或減少個體操作誤差。

但這種方法只能定性預測水稻堊白的高與低，不能精確的計算出堊白度，因此該方法還需進一步改進。同時，SPR檢測方法的探針只能根據已有的基因及序列進行設計，因而只能檢測一些已經克隆的基因，而不能檢測未知基因，加上探針修飾采用的是化學方法，這些都加大了探針設計的難度，今后在這一方面也有待進一步研究。

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（責任編輯：成 平）