逆境誘導型啟動子Mvnhx1缺失片段植物表達載體構建

摘 要：Mvnhx1啟動子是一種與鹽脅迫和干旱脅迫相關的逆境誘導型啟動子。為了更好地研究順式作用元件對Mvnhx1啟動子功能特點的影響，研究根據啟動子序列上與耐鹽和耐旱相關的順式作用元件分布位置不同設計引物，利用5'端缺失技術獲得11個不同長度的Mvnhx1啟動子缺失片段，分別構建不同缺失片段與報告基因GUS融合的植物表達載體。PCR擴增結果顯示，成功克隆獲得11個長度分別為1 135、1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp的片段。酶切鑒定顯示，成功構建了由Mvnhx1啟動子11個不同長度缺失片段調控的帶GUS基因的植物表達載體。

關鍵詞：誘導型啟動子；Mvnhx1；缺失片段；植物表達載體

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）06-0005-05

Construction of Adversity-induced Promoter Mvnhx1 Missing Fragment Plant

Expression Vector

REN Yan-ping，WANG Yi-hong，ZHU Shao-qing，WANG Ping

（College of Agronomy， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， PRC）

Abstract： The Mvnhx1 promoter is an adversity-inducible promoter associated with salt stress and drought stress. In order to better study the effect of cis-acting elements on the functional characteristics of Mvnhx1 promoter， the primers were designed according to the distribution position of cis-acting elements related to salt tolerance and drought tolerance in the promoter sequence， and the results were obtained by 5' Eleven different length of the Mvnhx1 promoter fragment were fragmented to construct a plant expression vector with different deletion fragments and the reporter gene GUS. The results of PCR amplification showed that 11 fragments were 1 135 bp， 1 027 bp， 974 bp， 967 bp， 858 bp， 727 bp， 726 bp， 564 bp， 366 bp， 352 bp and 210 bp， respectively. The results of restriction enzyme digestion showed that the plant expression vector of GUS gene regulated by 11 different deletions of Mvnhx1 promoter was successfully constructed.

Key words： inducible promoter； Mvnhx1； deletion fragment； plant expression vector

啟動子是位于基因上游區域調控基因轉錄的一段DNA序列，是一種重要的順式調控因子，決定基因轉錄的時空精確性和轉錄效率，從而調控下游基因的表達[1]。按照基因的表達方式，啟動子分為組成型、組織特異型和誘導型[2]。誘導型啟動子在特定的誘導因素下驅動基因表達，但是有些誘導型啟動子也具有組織特異性表達的特點[3]。這種類型的啟動子多以誘導信號的類型命名[4]。如干旱誘導型啟動子、鹽誘導型啟動子、光誘導型啟動子、赤霉素誘導型啟動子等。

鑒于組成型啟動子驅動外源基因表達不具備時間和組織特異性，往往使植物體內積累過量外源基因表達產物，導致植物表型、代謝受到嚴重影響。因此對誘導型啟動子的研究具有重要的理論和實踐意義。

研究表明，Mvnhx1啟動子是一種與鹽脅迫和干旱脅迫相關的逆境誘導型啟動子。為了更好地研究逆境誘導型啟動子Mvnhx1各個元件響應脅迫的特點，研究以逆境誘導型啟動子Mvnhx1為材料，根據該啟動子上不同順式作用元件位置和數量特點，利用5’缺失突變技術來獲得含有不同順式作用元件的逆境誘導型啟動子Mvnhx1缺失片段，并構建含有報告基因GUS的植物表達載體[5]，為Mvnhx1啟動子缺失片段功能驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料

pCAMBIA1304-Mvnhx1重組質粒。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據逆境誘導型啟動子Mvnhx1上與逆境相關的順式作用元件分布位置，利用5'端缺失技術及引物設計原則，將逆境誘導型啟動子Mvnhx1分為11個不同長度的缺失片段，上游引物分別為nqs1～nqs11（含SacI酶切位點），下游引物為nqs12（含NcoI酶切位點）。以重組質粒pCAMBIA1304-Mvnhx1為模板，進行PCR反應[6]。引物組合分別為nqs1+nqs12、nqs2+nqs12、nqs3+nqs12、nqs4+nqs12、nqs5+nqs12、nqs6+nqs12、nqs7+nqs12、nqs8+nqs12、nqs9+nqs12、nqs10+nqs12、nqs11+nqs12，產物分別命名為TNQS1～TNQS11。

1.2.2 Mvnhx1缺失片段與T載體連接 將擴增得到的目的片段切膠回收[7]，依次加入不同試劑，短暫離心5 s，25℃反應15 min，-20℃保存備用。

1.2.3 連接產物轉化 取大腸桿菌DH5a感受態細胞加入上述連接產物中，用移液槍輕輕吸打使其混勻，冰浴30 min；使用PCR儀42℃熱激90 s，冰浴2 min；將上述溶液轉移至含有800 μL無抗生素的LB液體培養基中，37℃恒溫培養50 min；2 000 r/min離心1 min，棄去上清液，保留200 μL菌液，涂于含有氨芐青霉素（工作濃度為50 μg/L）的LB固體培養基上，37℃環境正置培養30 min，待培養基表面溶液被吸收后，倒置培養12～16 h[8]。

1.2.4 重組質粒篩選鑒定 在過夜培養的固體培養基中，挑選5個單菌落接種于含有氨芐青霉素（工作濃度為50 μg/L）的LB液體培養基中，37℃ 220 r/min培養12～16 h。編號為TNQSn-1～TNQSn-5，其中n為1～11。依次進行菌液PCR鑒定、重組質粒DNA提取鑒定、單雙酶切鑒定，最終進行DNA序列測定。

1.2.5 表達載體的構建 將重組質粒TNQS1～TNQS11分別用SacI和NcoI雙酶切[9]，短暫離心30 s，37 ℃反應4 h。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，回收目的片段。將重組質粒pCAMBIA1304用SacI和NcoI雙酶切，短暫離心30 s，37 ℃反應4 h。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，使用膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段pCAMBIA1304大片段進行連接，16℃連接25 h，然后將連接產物進行轉化、搖菌、提質粒、酶切鑒定。

2 結果與分析

2.1 Mvnhx1缺失片段的獲得

2.1.1 缺失片段的確定 根據逆境誘導型啟動子Mvnhx1序列上與逆境相關的順式作用元件分布位置不同，以及引物設計原則，確定引物位置，如圖1所示。

2.1.2 Mvnhx1缺失片段PCR擴增結果 以重組質粒pCAMBIA1304-Mvnhx1為模板，PCR擴增獲得不同長度的Mvnhx1缺失片段。如圖2所示，擴增產物片段大小與預期值一致，缺失片段TNQS1～TNQS11大小依次為1 135、1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp。

2.1.3 Mvnhx1缺失片段膠回收產物電泳檢測結果 切膠回收目的片段，取10 μL用于電泳檢測。由圖3可知，已回收到單一的目的條帶，可用于連接反應。

2.1.4 重組質粒菌液PCR電泳檢測結果 使用引物nqs1+nqs12、nqs2+nqs12、nqs3+nqs12、nqs4+nqs12、nqs5+nqs12、nqs6+nqs12、nqs7+nqs12、nqs8+nqs12、nqs9+nqs12、nqs10+nqs12、nqs11+nqs12分別對重組質粒TNQS1-TNQS11進行PCR檢測，可以清楚地的得到與預期值一致的擴增片段（圖4），大小依次為1 135、

1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp。

2.1.5 重組質粒電泳檢測結果 對菌液PCR陽性菌株擴大培養，提取質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖5所示，質粒大小與預期值一致，大小依次為3 827、3 719、3 666、3 659、3 550、3 419、3 418、

3 256、3 058、3 044和4 039 bp。為了進一步證明重組質粒的正確性，將初步驗證正確的重組質粒進行序列測定。測序結果表明已獲得正確的Mvnhx1缺失片段TNQS1～TNQS11重組質粒。

2.2 Mvnhx1缺失片段植物表達載體構建

2.2.1 Mvnhx1缺失片段雙酶切目的片段的獲得 使用SacI和NcoI分別雙酶切TNQS1～TNQS11重組質粒，可依次切出1 135、1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp左右目的片段（圖6）。切膠回收目的片段，用于植物表達載體構建。

2.2.2 pCAMBIA1304雙酶切載體片段的獲得 使用SacI和NcoI雙酶切pCAMBIA1304重組質粒，可切出11 559 bp左右目的片段（圖7）。切膠回收目的片段，用于植物表達載體構建。

2.2.3 Mvnhx1缺失片段植物表達載體菌液PCR電泳檢測 利用DNA連接酶，將所回收的片段連接，從而構建出含有Mvnhx1啟動子各缺失片段和報告基因GUS的植物表達載體。將連接好的植物表達載體分別命名為pQS1～pQS11。菌液PCR擴增結果大小分別為1 135、1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp，與預期片段大小一致（圖8）。

2.2.4 Mvnhx1缺失片段植物表達載體質粒電泳檢測 Mvnhx1缺失片段植物表達載體pQS1～pQS11菌液PCR陽性菌株擴大培養，提取質粒DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，質粒片段大小分別為12 694、12 586、12 533、12 526、12 417、12 286、12 285、

12 123、11 925、11 911和11 769 bp，與預期值一致（圖9）。

2.2.5 Mvnhx1缺失片段植物表達載體雙酶切檢測 使用SacI和NcoI分別雙酶切pQS1～pQS11重組質粒，均可分別切出1 135、1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp左右目的片段，與預期值一致（圖10），初步證明pQS1～pQS11重組質粒構建正確。為了進一步證明重組質粒的正確性，將初步驗證正確的重組質粒進行序列測定。測序結果表明已獲得正確的pQS1～pQS11重組質粒。

3 討 論

啟動子功能分析方法包括生物信息學分析法和實驗分析法。生物信息學分析法主要依托數據庫初步預測啟動子序列，分析啟動子序列上包含的調控元件，為進一步確定啟動子功能奠定基礎。實驗分析法包括點突變分析、凝膠阻滯分析、瞬時表達分析、轉化分析和酵母單雜交分析，其中，點突變分析已成為現在最常用的研究啟動子功能的方法[10]。

前期研究結果顯示，Mvnhx1啟動子是一種與鹽脅

迫和干旱脅迫相關的誘導型啟動子。為了研究逆境誘

導型啟動子Mvnhx1各元件響應脅迫的特點，研究以逆

境誘導型啟動子Mvnhx1為材料，根據該啟動子上不

同順式作用元件位置和數量特點，利用5'缺失突變技

術來獲得含有不同順式作用元件的逆境誘導型啟動子

Mvnhx1缺失片段，并成功構建含有GUS報告基因[11-12]

的植物表達載體：Mvnhx1qs1∷Gus、Mvnhx1qs2∷

Gus、Mvnhx1qs3∷Gus、Mvnhx1qs4∷Gus、Mvnhx1qs5∷

Gus、Mvnhx1qs6∷Gus、Mvnhx1qs7∷Gus、Mvnhx1qs8∷

Gus、Mvnhx1qs9∷Gus、Mvnhx1qs10∷Gus、Mvnhx1qs11∷

Gus，為后續逆境誘導型啟動子Mvnhx1不同元件的作用研究打下了基礎。

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（責任編輯：成 平）