厚樸多酚的提取及體內抗氧化研究

摘要：抗氧化活性是研究動物抗衰老的重要方面。以厚樸樹皮為原料，比較超聲波法和浸提法提取厚樸多酚的含量差異，并研究了厚樸多酚對KM小鼠體內抗氧化活性和有害性。結果表明：采用超聲波提取法提取得到的多酚純度為76.67%，高于浸提法（64.11%）；厚樸多酚進行分組對比試驗，灌胃飼養試驗表明：KM小鼠血清中抑制羥自由基的能力和抗氧化成分（T-SOD、CAT、GSH-Px）的活性都得到提升，而有害的成分丙二醛MDA的含量有所降低。因此，厚樸多酚有抗氧化作用，有可能使動物健康生活，從而達到抗衰老的效果。

關鍵詞：厚樸多酚；KM小鼠；灌胃；血清；活性

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）03-0029-04

厚樸（Magnolia officinalis）為我國著名的中藥，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效，用于濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘咳。厚樸樹皮具有化濕導滯、下氣除滿、化食消痰、驅風鎮痛等功效；種子有明日益氣之功效，芽可作婦科藥用，還可以加入癌癥藥物中。目前，藿香正氣丸、開郁順氣丸、香砂養胃丸、潤通口服液等常用藥中均含有厚樸，其主要有效成分為厚樸酚與和厚樸酚。

厚樸樹皮中主要含有木脂素類化合物、揮發油、生物堿等成分。木脂素類化合物是厚樸中分離出的最主要化學成分，迄今為止，已分離出20多種，多數屬于新木脂素，主要有厚樸酚與和厚樸酚。厚樸中大約含有1%的揮發油，其中大部分都具有鎮靜作用，據研究，將提取的厚樸揮發油進行GC-MS研究，分離出了48種成分，按葉油醇及其異構體是主要成分，約占揮發油總量的40%～55%。揮發油普遍存在于樹皮、根皮、樹葉和花中，但是花與其他部位的揮發油的組分有較大的區別。厚樸樹皮中生物堿含量較高，王洪燕等對凹葉厚樸中生物堿的化學成分進行研究，得到9個異喹啉生物堿。除此之外，有學者從厚樸樹皮材料中分離出了槲皮苷、蘆丁、花生酸、棕櫚酮、二十六烷醇、β-谷甾醇、胡蘿卜苷。

自由基是人體生命活動中多種生化反應產生的正常代謝產物。在正常情況下，人體內的自由基是處于不斷產生與被清除的動態平衡中，自由基是機體有效的防御系統，對維持機體正常代謝有一定促進作用。但是自由基產生地過多或者清除地過慢，就會對人體細胞膜及大分子（如蛋白質、DNA）產生一系列損害，加速機體的衰老過程并誘發各種疾病。因此，一些化學合成的抗氧化劑被廣泛用于食品和醫藥領域。但最近研究表明合成的氧化劑具有各種缺陷，例如BHT、BHA，由于它們會對人體器官造成傷害而遭到禁用。因此，尋找天然高效和低毒性抗氧化劑日益受到關注。而厚樸是我國傳統的中草藥，在全國制藥行業中利用厚樸配方的中成藥多達200余種。近年來，一些研究已發現厚樸酚可以保護小腸、腦和后肢的缺血和再灌注損傷。深入研究厚樸多酚的抗氧化作用，可以為進一步研究和開發利用厚樸提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

KM小鼠，厚樸樹皮從湖南采購。主要器材：CTXNW-10B超聲循環提取機（北京弘祥隆生物技術開發有限公司），功率200w；SHZ-3循環水多用真空泵；藥物粉碎機；旋轉蒸發儀。主要試劑：沒食子酸；DPPH；ABTS；所用的試劑盒均從南京建成生物工程研究所購買，常用試劑均為AR級。

1.2試驗方法

1.2.1厚樸類化合物的提取（1）超聲波提取法。將烘干后的樹皮打碎成厚樸粉，過60目篩。參照李勝華對多穗柯總黃酮的提取工藝設計，稱取4 kg的厚樸粉加10倍量的80%乙醇浸泡24 h，超聲循環提取50 min，過濾得到粗多酚液，再減壓濃縮成漿狀，即可獲得粗提取液。（2）浸提法。該法由于工藝簡便、成本低、純度高而被廣泛使用，但此法提取率低。稱取250 g厚樸粉，加10倍量的80%乙醇浸泡。每次攪拌相隔約為8 h，每天攪拌3次，浸泡3 d。過濾得到粗多酚液，再減壓濃縮成漿狀，即可獲得粗提取液。

1.2.2厚樸多酚類化合物的純化 D-101型大孔樹脂先進行預處理，之后裝入層析柱，調節好流量1.0 mg/mL。將粗提取液倒入層析柱中，再依次用4L60%和30%的乙醇導入層析柱中進行純化。將純化得到的溶液倒入瓷盤中，放入65%烘箱中烘干，再用研缽研碎，即可得到厚樸多酚粉。將粉末放入4℃冰箱中備用。

1.2.3厚樸多酚粉的多酚含量測定 精確稱取0.100 g沒食子酸標準樣品。蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。該標準液濃度為0.1 mg/mL。準確量取上述標準液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于50mL容量瓶中，各加30mL水，搖勻，再加2.5mLFC試劑，充分搖勻。1 min之后，加入碳酸鈉溶液（20%）7.5 mL，混勻定容。水浴75℃下反應10min。于760nm波長下比色，測定吸光度，建立標準曲線，得到回歸方程（多酚含量以沒食子酸等價物表示）。

1.2.4厚樸多酚粉的多酚含量測定 準確稱取50mg厚樸多酚粉末于50 mL容量瓶中，配成母液，采用梯度稀釋制得100倍稀釋液和200倍稀釋液，移取1mL稀釋液進行測定。用紫外可見分光光度計測得吸光值，將其代入標準曲線回歸方程中，獲得樣品多酚濃度，再按公式（1）計算出多酚的含量。

多酚含量=（樣品濃度×樣品稀釋倍數）/取樣量×100% （1）

1.2.5厚樸多酚抗氧化活性試驗 （1）KM小鼠選擇。試驗所用小鼠為體重在30±3g的KM小鼠50只，雌雄各25只，然后進行隨機分組。分5組，每組5只雄、5只雌，雌雄分開，用苦味酸分別標記左上肢，右上肢，左下肢，右下肢，背部。（2）灌胃試驗。配制20mg/mL的厚樸多酚溶液，灌胃分高劑量組（400mg/kg）、中劑量組（200mg/kg）、低劑量組（100mg/kg）灌胃配制的厚樸多酚溶液，VC對照組用維生素C100 mg/kg劑量灌胃，空白對照組用水100mg/kg劑量灌胃。維生素每次灌胃前半小時配制。每兩天稱重1次。灌胃兩周，然后停止灌胃，休整1d之后取血處死。（3）取樣及處理。處死前提前先配制抗凝血劑，實驗用的抗凝血劑是檸檬酸鈉。試驗過程：摘眼珠取血保存并標記。小鼠取血滴加抗凝劑按7：1滴加，當天離心分離血漿，離心用4000 r/min，離心時間6min，標記好置于4℃冰箱臨時保存待用.

1.2.6指標測定 用考馬斯亮蘭測定蛋白；硫代巴比妥酸法測定MDA含量；黃嚓吟氧化酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）的活性；DNTB直接比色法測定谷光甘膚過氧化物酶（GSH-px）的活性；可見光比色法測定過氧化氫酶（CAT）的活性。測定試驗全部參照試劑盒的使用說明進行。

1.2.7數據處理 通過SPSS19.0軟件系統計算均值、標準差，動物試驗部分的相應數據用x±s表示，并用配對t檢驗和兩樣本均數比較t檢驗檢測其顯著性。

2結果與分析

2.1厚樸多酚粉的多酚含量測定

以沒食子酸溶液的濃度為橫坐標，沒食子酸不同濃度的溶液所對應的吸光值為縱坐標繪制沒食子酸標準曲線（圖1），得到沒食子酸標準曲線回歸方程為：y=89.179x-0.000 8，R²=0.9994，其中x：沒食子酸等價物質量濃度（mg/mL）；y：溶液在510mm處吸光值。厚樸多酚粉的吸光值及多酚含量如表1所示。

由表1可知，兩種方法提取厚樸多酚得到的純化物的含量均較高，超聲波提取法（76.67%）明顯優于浸提法（64.11%）。因此，試驗選取用超聲波提取法得到的純化物作為體內抗氧化的試驗材料。

2.2血清中蛋白含量測定

由表2可知，不同灌胃組之間的蛋白含量均達到了85 g/L，各組間蛋白含量沒有顯著差異（P>0.05），說明厚樸多酚對于小鼠血漿中的蛋白含量沒有顯著影響。

2.3抑制羥自由基能力的測定

用生理鹽水將血清（漿）按1：1、1：4、1：9、1：19、1：49、1：99等稀釋成一系列不同濃度的血漿，分別取不同濃度的血漿0.2 mL按血清的測定操作表進行檢測。

根據表3的試驗結果，并結合試劑盒要求抑制率在45%～55%效果最為理想，此次的試驗稀釋20倍時的抑制率在47.14%，符合要求，因此羥自由基測定試驗采用20倍稀釋液進行。經過預試驗，確定好了血漿樣品稀釋倍數，經稀釋后，采用上述相同方法進行試驗，羥自由基測定的結果見表4。

由表4可知，灌胃不同劑量厚樸多酚呈現的抑制羥自由基的能力差異顯著（P<0.05），同時從抑制率可以看出高劑量組（55.83%）>中劑量組（46.78%）>低劑量組（45.59%）>空白對照組（45.20%），說明厚樸多酚對小鼠的藥理作用中，厚樸多酚的量與血漿中抑制羥自由基的能力成正相關。對比VC對照組可以看出，厚樸多酚對小鼠的有同樣的藥理作用，提高血漿中抑制羥自由基的活力；但低劑量組與VC組的對比表明，相同劑量的厚樸多酚的作用不如VC。試驗結果表明，厚樸多酚類化合物增強了小鼠血清中抑制羥自由基的能力。這一結果與之前的許多研究結果是一致的。

2.4厚樸多酚類化合物對丙二醛（MDA）的影響

在脂質過氧化過程中，MDA是重要代謝產物之一，是由細胞膜上的不飽和脂肪酸在受到輻射和OH直接作用時產生的。因此，MDA的數量變化可表示脂質過氧化的程度，是判斷自由基損傷的重要指標之一。

由表5可知，高劑量組、中劑量組以及VC對照組的MDA含量與空白對照相比，存在顯著性差異（P<0.05），只有低劑量組沒有顯著性差異。因此可以認為厚樸多酚是有作用的。MDA的含量隨灌胃劑量的增加而減小，兩者之間存在一定的負相關性。此外，厚樸多酚中劑量組就達到了VC對照組中灌胃劑量100mg/kg的效果。由此表明：厚樸多酚類化合物有很好的抗氧化性。

2.5厚樸多酚類化合物對總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的影響

SOD作為體內重要的抗氧化酶，主要是清除超氧陰離子自由基，若生物體內SOD活力下降，就會引起脂質過氧化反應，會對生物體造成很大的損傷。SOD對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少。

由表6可知，低劑量組與空白對照組沒有顯著性差異，但是其他組均存在顯著性差異（P<0.05）。因此可以認為厚樸多酚類化合物還是有提高SOD活力的作用的。此外，SOD活力隨灌胃劑量的增加而上升，兩者之間存在一定的正相關性。低劑量組與VC對照組相比，可以認為VC對維持生物體SOD活力更佳。

2.6厚樸多酚類化合物對過氧化氫酶（CAT）活性的影響

由表7可知，中劑量組、高劑量組以及VC對照組與空白對照有顯著性差異（P<0.05）；高劑量組的活力大于中劑量組和低劑量組。灌胃劑量與活力數值呈正相關性，該結果與抑制羥自由基的能力得出的結論起到了相互補充的作用，而且兩者得出的結論相符。因此可以得出：厚樸多酚類化合物有起到體內抗氧化作用。

2.7厚樸多酚類化合物對谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的影響

GSH-PX是體內重要的抗氧化酶，主要是清除體內過氧化氫和有機氫過氧化物，并能夠特異地催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。由表8可知，高劑量組、中劑量組以及VC對照組的谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性比空白對照顯著提升（P<0.05）。對GSH-PX活力的影響可能是厚樸多酚類化合物自身發生化學反應，然后出現帶有電荷基團，它們與過氧化氫以及有機氫過氧化物反應，從而降低機體被氧化的風險，增強機體的抗氧化能力。也可能是因為厚樸多酚在機體內刺激了谷胱甘肽過氧化物酶的生成，使體內谷胱甘肽過氧化物酶含量增加，從而可以促進過氧化氫與GSH反應生成水及氧化型谷胱甘肽（GSSH），因此消耗掉機體內的過氧化物。

3結論與討論

厚樸多酚類化合物的提取采用了超聲波提取法與浸提法，兩種方法所獲純化物的多酚含量分別是76.67%和64.11%。因此試驗中采用了超聲波法提取厚樸多酚類化合物。

以KM小鼠為試驗材料進行體內抗氧化試驗，結果表明：一方面，KM小鼠血清中的蛋白含量比較接近，同時抑制羥自由基的能力和抗氧化活性成分（T-SOD、CAT、GSH-Px）的活性都有提升，說明KM小鼠的蛋白抗氧化能力得到了增強。另一方面，有害的成分（MDA）的含量有所降低，這有可能利于小鼠健康生長。由此可見，厚樸多酚類化合物具有抗氧化性作用，并可能使動物更健康生活，從而達到抗衰老的效果。