包涵體蛋白的純化層析復性技術研究進展

付強 吳全明 岳林濤

山西康寶生物制品股份有限公司 山西長治 046000

原核細胞表達外源基因時，其表達蛋白多會在細胞質內聚集形成包涵體，以包涵體為形態存在的蛋白質分子一般不具有正確的天然三維結構以及生物活性，因此臨床在進行相關實驗和研究的過程中必須通過復性操作技術對其進行復性。層析復性技術是一種蛋白質分離純化的方法并且得到了相對廣泛的應用；按照目前純化實驗中機制的不同，可將層析技術大致分為凝膠過濾層析、吸附性層析，本次研究則主要分析以上兩類包涵體蛋白的層析復性技術詳情（如下表1），現將研究概況做出整理報道。

表1 層析復性技術

1 凝膠過濾層析復性

凝膠過濾層析復性也稱體積排阻復性或分子篩復性。和常用的稀釋復性法（或透析法）比較，凝膠過濾層析復性能在較高的起始蛋白濃度下對蛋白進行復性，其具有較高的活性回收率，因此使得目標蛋白得到較高程度的純化[1]。因為復性過程始終在溶液中完成，這對于蛋白質的復性有利，此外在復性過程中合理選擇添加劑，會使得某些蛋白質的復性效率提高，同時降低應用成本，因此還需進一步研究總結。

2 吸附性層析復性

吸附性層析復性包括離子交換層析、疏水層析、擴張床層析以及親和層析等方法。

2.1 離子交換層析

變性蛋白質和固定相之間所帶的電荷存在不同，因此變性蛋白質多吸附在固定相的表面，這使得復性過程中蛋白質的聚集作用得到避免，逐步提高洗脫液的鹽濃度，變性蛋白質可洗脫出來。在進行離子交換層析復性實驗時，變性劑濃度的線性減少能有效抑制聚集體的形成，并且低濃度的變性劑能有效抑制復性中間體的聚集，增加復性的收率[2]。

2.2 疏水相互作用層析

疏水相互作用層析復性是利用蛋白疏水性基團與固定相表面疏水基團之間的疏水相互作用，使蛋白疏水區被結合，降低蛋白聚集，有利于從疏水核心開始的折疊并在柱上完成復性[3]。疏水層析復性常采用高濃度鹽上樣及平衡，因為高鹽環境會增強疏水作用而有利于吸附蛋白，但高鹽環境同樣會引起蛋白鹽析，因此疏水層析復性前需對蛋白的鹽溶液進行測試，避免堵塞層析柱。和其他的層析復性法相比較，疏水層析的固定相可促進變性蛋白質疏水核心的形成，因此疏水層析和其他層析法相比更利于復性，并能夠在最終實驗中獲得較高的活性回收率。

2.3 擴張床吸附層析

擴張床吸附層析最早主要是直接從細菌裂解變性液中捕獲并復性對應的目標蛋白，將細菌破碎液直接加入到高濃度的變性劑中，然后將其上樣到擴張好的柱床上，細胞碎片和不吸附的雜質會流穿掉，而變性蛋白則被吸附在固相上，此后通過逐漸降低變性劑的濃度誘使變性蛋白質折疊復性，將擴張床沉降后使用洗脫緩沖液將目標的蛋白洗脫下來，通過吸附、復性和洗脫，使變性蛋白得到復性，并獲得初步的純化。在此過程中細菌破碎液的清洗、復性和純化等結合為一體，實現了集成化操作，因此該復性技術的應用前景廣闊[4]。

2.4 親和層析

親和層析技術，充分運用固定相和目標蛋白質之間的特異性吸附作用，使得目標蛋白質可以在固定相中保留，從而導致變性劑和蛋白質分離，而后在洗脫過程中進行復性，依據親和層析復性的柱基成分不同，可以將親和層析復性分為脂質體親和層析、分子伴侶親和層析和固定化金屬親和層析等方法；因為配體和目標蛋白質之間的作用特異性強，因此不同配體和蛋白質間的作用差別較大，故而親和層析復性的整體機理相對較為復雜[5]。

3 結語

包涵體蛋白的純化層析復性技術眾多，本文所闡述的幾種方法具有共同之處，即能夠通過線性洗脫，在溫和的條件下實現復性和層析介質的隔離，降低了蛋白互相作用而產生的聚集，最終能夠在耗時較短的情況下實現蛋白的純化和復性。但是目前蛋白質的折疊和聚集機制尚未被準確做出解釋，因此對于不同蛋白質的詳細情況還需反復試驗證實，最終為臨床提供更優的復性方法選擇途徑。