穩定性冠心病患者外周血單核細胞亞型分布特征及影響因素

劉森 王丹 萬進東 侯霽芯 劉家欣 冉飛 李文章 王沛堅

成都醫學院第一附屬醫院心血管內科，衰老與血管穩態四川省高等學校重點實驗室（成都 610500）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）仍是當下我國最主要死亡原因之一［1］。未來我國CVD的發病率和患病率仍將穩步升高，特別是冠心病等疾病［2］。因此，CVD防治工作面臨巨大的挑戰。穩定性冠心病（stable coronary artery disease，SCAD）是冠心病中最常見的類型，動脈粥樣斑塊形成是其主要病理改變。炎癥標志物一直被認為與動脈粥樣硬化相關，甚至部分炎癥標志物可影響患者預后［3］。CANTOS三期臨床研究證實炎癥因子IL-1β特異性拮抗劑卡納單抗可在不影響膽固醇水平前提下，降低高敏C反應蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）水平而減少心肌梗死病人心血管臨床終點事件［4］。單核細胞介導人體固有免疫反應，在炎癥反應致動脈粥樣硬化中起重要作用［3］。隨著技術更新，流式細胞術分析單核細胞異質性受到關注，不同單核細胞亞型可能在動脈粥樣硬化疾病中參與不同的炎癥反應［5］。隨著研究深入，人們發現單核細胞可分為經典型單核細胞（classical monocytes，CMs；CD14++CD16-）、中間型單核細胞（intermediate monocytes，IMs；CD14++CD16+）、非經典型單核細胞（nonclassical monocytes，NCMs；CD14+CD16++）三型［6］。三型單核細胞在介導動脈粥樣硬化的炎癥反應中發揮不同作用［5］。目前尚無三色流式分析穩定性冠心病患者外周血單核細胞亞型特征及其影響因素的報道。本研究以SCAD及排除冠心病患者為研究對象，觀察兩種人群外周血單核細胞亞型的分布特征，評估IMs預測SCAD的價值，并探究影響IMs分布的因素，為SCAD早期診斷及治療提供依據。

1 資料與方法

1.1研究對象觀察納入2018年3月至2018年7月在成都醫學院第一附屬醫院心血管內科住院并行冠狀動脈造影（coronary angiography，CAG）患者162例。納入標準：根據臨床表現、實驗室檢查、心電圖及CAG診斷SCAD患者96例（SCAD組），非冠心病患者66例（對照組）；排除標準：排除既往有經皮冠狀動脈介入史、心胸外科手術史、重大外傷史，合并貧血、慢性營養不良、心房顫動、先天性心臟病，嚴重心力衰竭、肝臟、腎臟疾病，惡性腫瘤、血液系統、全身免疫性疾病及使用免疫抑制藥者。

1.2一般資料包括年齡、性別、身高、體質量、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史等，并計算體質指數（body mass index，BMI）。所有患者入院后均空腹采集靜脈血，完善血常規、肝功能、腎功能、脂類測定、hs-CRP、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）等指標。

1.3CAG方法與判定標準采用Judkins法行多體位CAG，用造影機的測量系統由2名有經驗的介入心臟病學醫師進行判讀，分析左主干、前降支、回旋支、右冠狀動脈及其大分支的狹窄程度。以病變管腔最重處狹窄≥50%記為陽性，診斷冠心病，＜50%記為陰性，診斷非冠心病。

1.4三色流式細胞術分析外周血單核細胞亞型對所有入選患者抽取肘靜脈血2 mL，置于二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，混勻后2 h內進行染色及流式上機。實驗抗體如下：抗CD14-FITC、抗CD16-PE、抗 CD86-PE-Cy5，均購于美國 eBioscience公司。BD Acurri C6流式細胞儀購于美國BD公司。cell staining buffer購于美國bioLegend公司，紅細胞裂解液購于中國博士德公司。

1.4.1樣品制備（1）取1.5 mL高壓滅菌后的EP管若干，標記全陰管（無抗體）、單陽管（分別加入2 μL 的抗 CD14-FITC、抗 CD16-PE、抗 CD86-PECy5等3種流式熒光抗體之一）、全陽管（分別加入2 μL上述三種抗體）。（2）應用全陰管、單陽管調整各個通道的熒光補償。（3）將其中一名受試者全血100 μL加入至全陰管、單陽管，應用移液器吹打混勾，避光孵育15 min進行流式細胞儀檢測方案的調試。（4）將受試者100 μL全血分別加入相應單陽管、全陽管中，移液器吹打混勻。避光孵育15 min，進行免疫熒光染色。（5）向管內加1 mL紅細胞裂解液，渦旋混勻。避光孵育10 min，充分裂解紅細胞，離心棄上清，加入1 mL cell staining buffer重復洗滌2～3次，最后定容至100 μL。選擇調制好的流式程序進行檢測。

1.4.2流式上機（1）數據采集：抗體熒光染料FITC，PE，PE-Cy5的激發光波長均為488nm，發射光波長分別為525 nm，572 nm，675 nm。在流式細胞儀對應的通道分別為 FL1，FL2，FL3。（2）根據FSC vs SSC（即前向散射光forward scatter，FSC和側向散射光side scatter，SSC）調整流式細胞儀程序電壓，建立二維點圖，初步顯示外周血各群細胞。（3）根據二維點圖圈出粒細胞、淋巴細胞及單核細胞設門P1。（4）在P1基礎上建立橫坐標為CD86-PE-Cy5，縱坐標為SSC的散點圖。根據細胞表達CD86熒光強度的不同和細胞內顆粒的復雜程度，圈出外周血單個核細胞設門P3。（5）在P3基礎上，以CD14-FITC為橫坐標，以CD16-PE為縱坐標作二維點圖。將單核細胞進一步分為CD14++CD16-亞型、CD14++CD16+亞型和CD14+CD16++亞型，記錄各亞型比例。見圖1。

圖1 三色流式分析外周血單核細胞亞型Fig.1 A three-color flow cytometric analysis for peripheral blood monocyte subset

1.5 統計學方法應用SPSS 21.0統計學軟件進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，Pearson相關性分析；計數資料以率或者百分數表示，組間比較采用X2檢驗；非正態性分布資料以中位數和四分位數間距M（Q1～Q3）表示，采用Mann-Whitney U檢驗，Spearman秩相關性分析。對具有差異的因素校準影響因素后進行多因素Logistic回歸分析。利用受試者工作特征（ROC）曲線分析單核細胞亞型預測SCAD的價值，并計算最佳界值及陽性預測值，用曲線下面積（AUC）及Z檢驗來判別預測能力及檢驗差異。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般臨床資料比較見表1。

2.2 多因素Logistic回歸分析校正混雜因素后，外周血IMs比例、hs-CRP水平為SCAD獨立相關因素。進一步校正年齡、性別、吸煙、肥胖、高血壓病史、糖尿病史、高脂血癥病史等冠心病高危因素后，IMs與hs-CRP獨立相關。見表2。

表1 兩組患者一般臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics between SCAD and control group

表2 SCAD多因素Logistic回歸分析Tab.2 Multivariate analysis of clinical indicators and SCAD

2.3 外周血IMs比例與hs-CRP水平相關性分析外周血IMs比例與hs-CRP水平呈顯著性正相關。見圖2。

2.4 外周血IMs比例預測SCAD的ROC曲線外周血IMs比例ROC曲線 AUC=0.824，95%CI：0.756～ 0.879，P＜ 0.01；敏感度0.625，特異度0.955；IMs對應診斷SCAD臨界值：8.68%；陽性預測價值85.7%。見圖3。

3 討論

炎癥反應學說是動脈粥樣硬化形成主流學說之一。從血管保護屏障內皮細胞損傷開始，機體炎癥反應即被激活，通過單核細胞參與的固有免疫反應及淋巴細胞介導的獲得性免疫反應釋放大量的炎癥因子，如促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6，抗炎性因子IL-4、IL-10、IL-13。在長期慢性炎癥損傷及修復過程中，動脈粥樣斑塊逐漸形成［7］。部分炎癥標志物可預測心血管疾病發生、評估病變程度、影響預后等。CRP是機體響應IL-6等促炎性因子的表達，由肝細胞合成的炎癥蛋白，被認為與動脈粥樣硬化的發生相關［8］。SUNG等［9］發現男性C反應蛋白水平顯著高于女性，在長達近5年的隨訪中發現男性CRP水平與CVD及全因死亡率相關，且獨立于其它心血管危險因素。CRP水平不僅影響預后，還可判斷不穩定性心絞痛患者病情，CRP與冠狀動脈病變狹窄程度密切相關［10］。一方面，CRP可上調內皮粘附分子表達誘導單核細胞粘附于受損傷內皮，促進巨噬細胞泡沫化、分泌組織因子加快動脈粥樣硬化進程；另一方面，CRP也受到單核細胞分泌炎癥因子的調節［11］。本研究結果顯示SCAD患者hs-CRP水平顯著高于非冠心病患者，進一步行多因素分析提示hs-CRP與SCAD獨立相關。但研究樣本例數較少，且入選患者就診時間較集中，不排除假陽性可能。

圖3 外周血IMs比例預測SCAD的ROC曲線Fig.3 ROC curve of predicting SCAD for peripheral blood IMs

單核細胞是機體固有免疫的重要組成部分，參與病原微生物的吞噬、抗原呈遞、T細胞功能調節等重要過程。單核細胞被證實具有異質性，既往研究大多將單核細胞分為經典與非經典兩型，OZAKI等［12］基于這種二分法的研究發現循環中CD14+CD16+單核細胞亞型是穩定性心絞痛患者冠狀動脈嚴重程度的生物學標志之一。隨著對單核細胞異質性研究的深入，人們根據單核細胞表面脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）受體（CD14）和IgG Fc段受體γIII（FcyIII）（CD16）的表達水平，將單核細胞分為3個亞型：CMs，IMs，NCMs。不同表型分化的單核細胞存在功能差異及互補，參與不同的炎癥反應，在特定情況下也可發生表型轉化［13］。IMs比例增加被認為與動脈粥樣硬化性心血管疾病相關［14］。IMs比例還被認為可能影響心血管疾病預后。在一項隊列研究中，IMs可獨立預測住院行CAG患者的心血管事件［15］。本研究證實SCAD患者外周血IMs比例顯著高于非冠心病患者，與SCAD獨立相關，且還提出了IMs比例預測SCAD的最佳臨界值。

IMs與動脈粥樣硬化形成的聯系被認為可能與促炎性因子表達相關。IMs介導分泌TNF-α和IL-1β等促炎性細胞因子均強于其他兩型細胞，且在許多慢性炎癥性疾病中IMs比例顯著增多［16］。英國學者通過動態觀察急性ST段抬高性心肌梗死患者外周血單核細胞亞型變化，發現急性期IMs比例顯著升高，且與IL-6的升高一致［17］。KRYCHTIUK等［18］將冠心病患者按照脂蛋白a水平劃分高水平組和低水平組，結果顯示高水平組IMs比例顯著高于低水平組，且促炎性因子IL-6、CRP顯著升高，而抗炎性因子IL-10無明顯差異。MOKHTAR等［19］采用流式設門策略，將單核細胞分為CD14+CD16-，CD14+CD16+兩型，證實CD14+CD16+的比例與穩定性心絞痛患者冠狀動脈病變程度及CRP水平呈正相關。日本學者還發現穩定性心絞痛患者IMs較其他兩型細胞的TLR-4表達量更高，且與斑塊的穩定性相關［20］。本研究證實SCAD患者外周血IMs比例與血漿hs-CRP水平呈正相關。目前大多數研究支持IMs介導促炎性反應，參與動脈粥樣硬化的發生發展，至于IMs參與具體炎癥反應通路及機制尚無統一結論，也缺乏基礎實驗及證據等級更高的隨機、雙盲、多中心、大樣本的臨床研究證實。

單核細胞亞型概念的提出以及各亞型功能的確定有助于深入探討疾病發生的本質。IMs比例可能與SCAD相關，可望成為SCAD潛在的防治靶點。通過干預單核細胞表型影響炎性分子表達可能為SCAD的防治提供新的信息。