糖尿病腎病通過轉(zhuǎn)錄激活因子3誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡機(jī)制

梁順 張鴻 杜玥 李中和 章斌 杜藝

1中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腎內(nèi)科（廣東珠海 519000）；2廣東省人民醫(yī)院腎內(nèi)科廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院（廣州510080）

糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一，其發(fā)病率在逐年上升［1］。越來越多的研究報(bào)道證實(shí)腎小球足細(xì)胞在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用［2-4］。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明高糖導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡增加［5-6］，但足細(xì)胞凋亡機(jī)制尚未完全明確。國內(nèi)外大量研究表明Yes相關(guān)蛋白（yesassociated protein，YAP）是足細(xì)胞凋亡生理拮抗劑，對(duì)保護(hù)足細(xì)胞具有重要作用［7-10］。轉(zhuǎn)錄激活因子3（activating transcription factor 3，ATF3）是具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（bZIP）的轉(zhuǎn)錄因子，通過bZIP形成二聚體激活或抑制轉(zhuǎn)錄［11］。研究發(fā)現(xiàn)ATF3具有雙重效應(yīng)，在不同細(xì)胞中可促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡［12-13］，但在腎小球足細(xì)胞中的凋亡效應(yīng)的相關(guān)研究報(bào)道甚少。本研究擬觀察糖尿病小鼠模型腎組織足細(xì)胞和體外培養(yǎng)高糖（HG）刺激的足細(xì)胞中ATF3的表達(dá)情況，并探究ATF3對(duì)足細(xì)胞的凋亡效應(yīng)，初步探究其凋亡機(jī)制與YAP的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1儀器和試劑RMPI 1640培養(yǎng)基（CORNING）；0.05%胰酶、胎牛血清（Gibco）；γ干擾素（ProSpec）；核漿蛋白提取試劑盒（凱基）；Annexin V-APC/V450細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BD Bioscience）；GAPDH抗體（Bioworld）；ATF3抗體（Abcam）；YAP、Histone、Bcl-2抗體（CST）；BAX、Synaptopodin抗體（Santa）；熒光二抗488、熒光二抗555（Thermo）；腺病毒GFP-ATF3（漢恒生物）；Trizol（Life Technologies）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GREEN（Takara）。

1.2足細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組條件永生化小鼠足細(xì)胞系由Rush University Medical Center惠贈(zèng)。足細(xì)胞復(fù)蘇后用含（2～4）×104U/L重組小鼠γ干擾素及10%胎牛血清（FBS）的RMPI 1640培養(yǎng)基先在33℃、5%CO2培養(yǎng)箱中增殖，細(xì)胞融合達(dá)到70%～80%時(shí)，用不含重組小鼠γ干擾素的5%FBS RMPI 1640培養(yǎng)基在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中分化培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)10～12 d后，足細(xì)胞分化成熟。本實(shí)驗(yàn)所有足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均在分化成熟后進(jìn)行。足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）為明確HG誘導(dǎo)ATF3的時(shí)間效應(yīng)，分組如下：HG（30 mmol/L）培養(yǎng)刺激0、1、2、4、6 h；（2）為探討過表達(dá)ATF3對(duì)足細(xì)胞損傷的影響及其機(jī)制，分組如下：Vector組（給予轉(zhuǎn)染GFP基因的腺病毒干預(yù)24 h，此為過表達(dá)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組）、ATF3組（給予轉(zhuǎn)染GFP-ATF3基因的腺病毒干預(yù)24 h）；（3）為探究HG刺激下ATF3細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，分組如下：Con組（未加干預(yù)對(duì)照組）、HG組（30 mmol/L HG干預(yù)2 h）。

1.3小鼠腎組織切片本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都通過了廣東省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理管理委員會(huì)批準(zhǔn)。db/db小鼠和同一遺傳背景野生型（BKS）小鼠均購買于南京大學(xué)動(dòng)物研究中心，飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠被麻醉后（氯胺酮70 mg/kg腹腔注射），處死取腎臟組織做冰凍切片，保持于-80℃冰箱。

1.4免疫熒光將細(xì)胞或腎組織用冰甲醇固定、0.5%Triton X-100透化、5%胎牛血清蛋白封閉，然后滴加一抗過夜，避光加入相應(yīng)的熒光二抗，封片，通過激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.5Western blot檢測(cè)提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度，加入變性液煮沸變性。蛋白經(jīng)恒壓80 V電泳，恒流200 mA、2 h電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%牛奶封閉，加入相應(yīng)一抗二抗孵育，用化學(xué)發(fā)光液曝光，Image J軟件分析灰度值。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCRTrizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒說明書操作檢測(cè)目的基因表達(dá)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，定量結(jié)果取平均值。引物序列見表1。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集各組細(xì)胞，用PBS洗一遍，用200 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-APC 和 1 μL V450避光共孵育15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法符合正態(tài)分布計(jì)量資料用± s表示，組間比較用單因素方差分析，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ATF3在db/db小鼠腎組織足細(xì)胞中表達(dá)增加通過組織免疫熒光染色，用腎小球足細(xì)胞標(biāo)記蛋白Synaptopodin來定位足細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示與對(duì)照BKS小鼠相比，糖尿病模型db/db小鼠的腎組織足細(xì)胞中ATF3的表達(dá)量明顯增加。見圖1。

圖1 ATF3在db/db小鼠腎組織中表達(dá)增加（×400）Fig.1 ATF3 was upregulated in podocytes of db/db mouse（× 400）

2.2 HG刺激足細(xì)胞ATF3表達(dá)增加體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞分化成熟后，用HG分別處理足細(xì)胞0、1、2、4、6 h。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 顯示 ATF3 mRNA在1 h和2 h時(shí)明顯增加（均P＜0.05），隨后逐漸減少，到6 h基本恢復(fù)到基線水平（P＞0.05）。Western blot結(jié)果顯示，ATF3蛋白在2 h時(shí)明顯增加（1、2、4 h與0 h對(duì)比，均P ＜ 0.05），隨后逐漸減少，到6 h基本恢復(fù)到基線水平（P＞0.05）。見圖2。

圖2 ATF3在高糖干預(yù)的足細(xì)胞中表達(dá)增加Fig.2 ATF3 was increased in high glucose（HG）-treated podoctes

2.3 過表達(dá)ATF3增加促進(jìn)足細(xì)胞凋亡熒光定量PCR和Western印跡驗(yàn)證足細(xì)胞過表達(dá)效應(yīng)，結(jié)果顯示與Vector組相比ATF3組無論是mRNA水平還是蛋白水平，ATF3過表達(dá)效果都非常明顯（均P＜0.05）。見圖3a、3b。過表達(dá)足細(xì)胞ATF3后，通過Annexin V-APC/V450雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示足細(xì)胞過表達(dá)ATF3后，凋亡比率明顯增加（P ＜ 0.05）。見圖3c、3d、3e。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)因子BAX和Bcl-2表達(dá)，熒光定量PCR顯示過表達(dá)足細(xì)胞ATF3后，促凋亡基因BAX表達(dá)上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05）。見圖3f。Western blot結(jié)果顯示過表達(dá)足細(xì)胞ATF3后，促凋亡蛋白BAX表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少（均P＜0.05）。見圖3g。因此，ATF3表達(dá)增高后對(duì)足細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡效應(yīng)。

2.4 HG刺激下誘導(dǎo)足細(xì)胞核ATF3表達(dá)增加HG刺激足細(xì)胞2 h后，通過足細(xì)胞骨架蛋白Synaptopodin定位足細(xì)胞，DAPI標(biāo)記足細(xì)胞核，免疫熒光染色后結(jié)果顯示，與Con組比較，HG組ATF3表達(dá)明顯增加，且主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。見圖4a。同樣用HG刺激足細(xì)胞2 h后，提取足細(xì)胞核蛋白，通過Western blot檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)ATF3表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，HG組足細(xì)胞核內(nèi)ATF3蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）。見圖4b。

圖3 過表達(dá)ATF3促進(jìn)足細(xì)胞凋亡Fig.3 Overexpression of ATF3 increased podocyte apoptosis

圖4 高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞核ATF3表達(dá)增加Fig.4 The translocation of ATF3 to the nucleus was increased in HG-treated podocytes

2.5 ATF3下調(diào)YAP表達(dá)過表達(dá)足細(xì)胞ATF3后，與Vector組相比，ATF3組中足細(xì)胞YAP mRNA表達(dá)減少（P＜0.05）。見圖5a。同樣，在過表達(dá)足細(xì)胞ATF3后，通過Western blot檢測(cè)足細(xì)胞中YAP表達(dá)情況，結(jié)果顯示與Vector組相比，ATF3組足細(xì)胞中YAP蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。見圖5b。

圖5 ATF3下調(diào)YAP表達(dá)Fig.5 ATF3 down-regulated the expression of YAP

3 討論

近年來，隨著全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展，生活質(zhì)量的提高，全世界的糖尿病尤其是2型糖尿病的發(fā)病率急劇增加［14］。世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)計(jì)，到2030年全球?qū)⒂?.66億糖尿病患者，占全球人口的4.4%［15］。糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。而目前對(duì)糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，因此探究糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制是我們亟需解決的重任。近年來，多項(xiàng)研究表明足細(xì)胞的損傷在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［2-4］。足細(xì)胞，一種高度分化的上皮細(xì)胞，位于腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)的外層，和基底膜、內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障。足細(xì)胞病以蛋白尿?yàn)榈湫吞卣鳎瑤缀鯀⑴c了所有腎小球疾病的病理改變，也是臨床治療的重要靶點(diǎn)［16］。因此闡明足細(xì)胞損傷機(jī)制具有重要意義。ATF3是轉(zhuǎn)錄因子ATF/CERB家族成員之一，具有DNA結(jié)合位點(diǎn)的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（bZIP）［17］，ATF3只有依靠其bZIP結(jié)構(gòu)形成二聚體才能發(fā)揮作用［11］。在卵巢細(xì)胞［18］、胰島細(xì)胞［13］、內(nèi)皮細(xì)胞［19］中，ATF3的表達(dá)被證明是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的。然而在心肌細(xì)胞［12］、神經(jīng)細(xì)胞［20］中ATF3具有抗凋亡效應(yīng)。雖然ATF3在其他細(xì)胞中已得到大量的研究，對(duì)凋亡具有雙向效應(yīng)，但在高糖刺激性下足細(xì)胞中ATF3的表達(dá)情況及是否具有凋亡效應(yīng)的研究甚少。

本研究在糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)腎臟足細(xì)胞中有表達(dá)ATF3，且與對(duì)照非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠的足細(xì)胞中ATF3表達(dá)明顯增多。因此本研究通過進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)，通過高糖干預(yù)足細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在高糖刺激下短時(shí)間內(nèi)ATF3表達(dá)上調(diào)。無論在動(dòng)物模型還是體外培養(yǎng)足細(xì)胞中，在高糖刺激下足細(xì)胞中ATF3表達(dá)量都上調(diào)。表達(dá)上調(diào)的ATF3是否對(duì)足細(xì)胞具有凋亡效應(yīng)，需要通過進(jìn)一步過表達(dá)足細(xì)胞中ATF3進(jìn)行探究。研究表明當(dāng)足細(xì)胞凋亡增加時(shí)，促凋亡因子BAX表達(dá)上調(diào)［5］，抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)下調(diào)［21］。在本研究中，足細(xì)胞過表達(dá)ATF3后，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞凋亡比率明顯增加。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)因子發(fā)現(xiàn)過表達(dá)足細(xì)胞ATF3后，足細(xì)胞BAX表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少。綜上所述，高糖刺激足細(xì)胞中ATF3表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)的ATF3對(duì)足細(xì)胞具有促凋亡作用。

為探究高糖刺激下增多的足細(xì)胞ATF3是如何實(shí)現(xiàn)凋亡效應(yīng)的，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究ATF3可能調(diào)控的相關(guān)因子。YAP是Hippo通路中最主要的轉(zhuǎn)錄因子之一，具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域而缺少DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，優(yōu)先與具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的因子結(jié)合，介導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)［22］。大量的研究表明YAP具有促細(xì)胞增殖，抗細(xì)胞凋亡的作用［23］。在腎臟方面，YAP在正常足細(xì)胞核內(nèi)大量表達(dá)，是足細(xì)胞凋亡的生理拮抗劑，對(duì)保護(hù)足細(xì)胞，及糖尿病腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化、慢性腎衰竭等的發(fā)生發(fā)展具有重要作用［10］。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)HG處理的足細(xì)胞中也存在YAP的表達(dá)，且高糖刺激下足細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞核內(nèi)的YAP表達(dá)減少［7］。本次研究發(fā)現(xiàn)ATF3在高糖的刺激下，主要在足細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)增多。高糖刺激下足細(xì)胞核內(nèi)增多的促進(jìn)凋亡的ATF3是否與細(xì)胞核內(nèi)抑制凋亡的YAP相關(guān)仍待探討。本研究首次探究ATF3與YAP之間的關(guān)聯(lián)，在國內(nèi)外研究中在尚無ATF3參與調(diào)控YAP的相關(guān)報(bào)道。通過過表達(dá)足細(xì)胞ATF3后檢測(cè)足細(xì)胞中YAP的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，無論是YAP的mRNA水平還是蛋白水平都在ATF3過表達(dá)后下調(diào)了。因此足細(xì)胞中ATF3參與調(diào)控YAP的表達(dá)，ATF3介導(dǎo)的凋亡效應(yīng)是通過下調(diào)足細(xì)胞凋亡生理拮抗劑YAP實(shí)現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)高糖損傷下，足細(xì)胞中ATF3表達(dá)增加，表達(dá)上調(diào)的ATF3促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，其凋亡機(jī)制為高糖刺激下誘導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)ATF3表達(dá)增加，ATF3通過下調(diào)足細(xì)胞核內(nèi)凋亡生理拮抗劑YAP導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。本研究對(duì)高糖損傷足細(xì)胞及糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制有一個(gè)新的認(rèn)識(shí)，豐富了YAP抗足細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。本研究后續(xù)還需進(jìn)一步通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)深入探究ATF3是如何調(diào)控YAP，并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ATF3與YAP的關(guān)系及對(duì)糖尿病腎病的影響，為ATF3應(yīng)用于臨床改善糖尿病腎病患者足細(xì)胞損傷和蛋白尿的發(fā)生提供更多理論依據(jù)。