熱休克蛋白90α通過增強鈣庫操作性鈣離子內流活性促進肝癌細胞轉移

梁永紅 馮超 周忠信

南方醫科大學第三附屬醫院介入血管外科（廣州 510630）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是我國較為常見的惡性腫瘤［1-2］。因肝癌細胞具有很強的侵襲與轉移能力，很多肝癌被發現時已經發生轉移，嚴重影響患者的預后［3-4］。因此，進一步闡明肝癌細胞侵襲與轉移的機制，是肝癌防治的熱點。鈣庫依耐性Ca2+內流（store-operated Ca2+entry，SOCE）是細胞外鈣內流的主要通道，既往的研究發現抑制SOCE可減少肝癌細胞的侵襲與轉移［5-6］。熱休克蛋白 90（heat shock protein 90，Hsp90）是細胞內調控蛋白折疊、穩定等的重要蛋白，分為Hsp90α、Hsp90β、Grp94、TRAP1四種亞型［7-8］。其分泌到細胞外的 Hsp90α（extracellular Hsp90α，eHsp90α）被證實與腫瘤的侵襲與轉移有關［9-10］，但其在肝癌轉移中的作用和機制目前尚未見報道，是否可以調控SOCE也未有報道。因此，本研究皆指著探討eHsp90α對肝癌細胞轉移的影響，并探討其中的機制。

1 材料與方法

1.1材料50 kDa超濾管（Merck公司，愛爾蘭），人重組 Hsp90α（hrHsp90α）（StressMarq公司，英國），Transwell小室（Corning公司，美國），Fluo-4（同仁公司，日本），Hsp90α兔來源多克隆一抗（Abcam公司，美國），STIM1兔來源多克隆一抗（sigma公司，美國），STIM1鼠來源多克隆一抗（abcam公司，美國），ORAI1兔來源多克隆一抗（sigma公司，美國），β-actin鼠來源單克隆一抗（CST公司，美國），抗兔或鼠HRP標記二抗（中杉金橋，北京），抗兔或鼠熒光標記二抗（life，美國），高糖型DMEM、胎牛血清（Gibco公司，美國），胰蛋白酶（吉諾公司，中國），Lipofectamine?2000 Reagent（invitrogen，美國）。

1.2方法

1.2.1細胞培養正常肝細胞系LO-2和肝癌細胞系 HepG2、HL-7702、SNU-449、MHCC87H 和 HCCLM3由南方醫科大學第三附屬醫院實驗室保留細胞。用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在5%CO2的37℃孵箱中培養。

1.2.2細胞上清濃縮5 mL預冷的PBS加入超濾管，4℃、1 000 g/min、5 min離心以激活超濾管。棄超濾管中PBS，加入收集的上清液。4℃、5 000 g/min，離心時間視情況而定，至上室液體量為100～200 μL時。棄超濾出的液體，加入1 mL的預冷的PBS，用移液槍進行仔細吹打，由上而下，反復吹打5 min，再加入預冷的PBS定容到5 mL。同樣的條件下進行離心。如此用PBS置換2次。最后一次超濾至液體剩余50 μL以下。最后用移液槍進行仔細吹打，由上而下，反復吹打5 min，回收液體，加入預冷的PBS定容至50 μL。再加入5 × Loading buffer 12.5 μL，放入沸水中，震蕩煮沸10 min。樣品凍-20℃，后續Western blot檢測Hsp90α。

1.2.3小干擾RNA轉染si-STIM1和對照si-NC小干擾RNA轉染由上海吉瑪生物公司合成。si-STIM1干擾系列：AGGTGGAGGTGCAATATTA，si-NC干擾系列：AATTCTCCGAACGTGTCACGT。轉染步驟按Lipofectamine?2000 Reagent說明進行。轉染48 h后，Western blot檢測效率。

1.2.4Western blot檢測提取全細胞胞漿蛋白，加入5×loading buffer，沸水煮10 min后-20℃保存。SDS-PAGE 膠分離蛋白（90 V，1.5 h），轉膜（冰浴，90V，2 h），封閉（5% 脫脂奶粉，常溫，2 h），STIM1、ORAI1、Hsp90α、β-actin一抗（1∶1 000）4 ℃過夜孵育，二抗（1∶5 000）常溫1 h，TBST 5 min/次×3次洗膜后ECL顯影。

1.2.5Transwell實驗50 mg/L Matrigel 1∶5稀釋，50 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風干。使用前用上室加入100 μL無血清培養基DMEM 37℃濕化30 min。細胞消化后用無血清培養基DMEM制成細胞懸液，調整細胞密度為5×104個/mL。吸取200 μL細胞懸液加入Transwell小室上室，下室加入含10%血清的DMEM 600 μL。18 h后取出小室，去除培養基，4%多聚甲醛固定10 min后，結晶紫染色2 h，顯微鏡下拍照。

1.2.6劃痕實驗先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。細胞種于6孔板中，細胞長至95%后饑餓24 h。用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細胞3次，去處劃下的細胞，加入無血清培養基。放入37℃5%CO2培養箱，培養。按0和24 h取樣，拍照。

1.2.7SOCE活性細胞1×105個種于confocal小皿中，處理好后37℃Hank液洗3次，加入Fluo-4（1∶200）37℃、避光染色30 min。D-Hank液洗3次，加入200 μL D-Hank液。Confocal檢測熒光值變化。1.2.8免疫熒光細胞種于confocal皿中，處理好后TG室溫刺激10 min。PBS洗一次，4%多聚甲醛室溫固定10 min。PBS洗3次，加入0.25%曲拉通室溫通透10 min。5%BSA封閉30 min，加入1∶100的SITM1（鼠來源）和ORAI1（兔來源）一抗，4℃孵育過夜。PBS洗3次，加入抗兔和抗鼠的熒光二抗（1∶200），室溫避光孵育1 h。PBS避光洗3次，加入DAPI避光孵育5 min。PBS避光洗3次，confocal拍照。

1.3統計學方法應用SPSS 13.0統計學軟件，采用One-way ANOVA方差分析法，首先利用Levene方法進行方差齊性檢驗，確定方差齊性且整體比較組間差異有統計學意義后進一步作多重比較，多重比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1eHsp90α促進肝癌細胞轉移檢測正常肝細胞系LO-2和肝癌細胞系HepG2、HL-7702、SNU-449、MHCC87H和HCCLM3培養基上清中eHsp90α的水平，結果顯示肝癌細胞系中eHsp90α較正常肝細胞系顯著增加；高度轉移能力的MHCC87H和HCCLM3細胞中eHsp90α較低轉移能力的HepG2、HL-7702和SNU-449顯著升高（圖1A）。同時，運用hrHsp90α刺激低轉移能力的HepG2，發現其可以明顯促進HepG2轉移（圖1B、1C）。提示，eHsp90α有促進肝癌細胞轉移的作用。

圖1 eHsp90α對肝癌細胞轉移的影響Fig.1 The effect of eHsp90α on hepatocellular carcinoma cells metastasis

2.2 SOCE調控肝癌細胞轉移SOCE作為細胞外鈣離子內流的主要方式，在很多腫瘤細胞中都有調節轉移的作用。因此，通過檢測肝癌細胞系SOCE的水平，發現高度轉移能力的MHCC87H和HCCLM3細胞中SOCE的活性較低轉移能力的HepG2、HL-7702和SNU-449顯著升高（圖2A）。同時也觀察到，SOCE的關鍵蛋白STIM1標準在MHCC87H和HCCLM3細胞中的表達較HepG2、HL-7702和SNU-449顯著升高，但ORAI1蛋白表達差異不大（圖2B和2C）。進一步用SOCE抑制劑2-APB和SKF-98059（SKF）抑制SOCE的活性及鈣離子拮抗劑EGTA（圖2D），可以顯著抑制MHCC87H的高轉移能力（圖2E）。由此提示，SOCE的活性影響肝癌細胞轉移。

2.3 下調STIM1表達抑制肝癌細胞轉移在高轉移并高表達STIM1的MHCC87H細胞系中，下調STIM1表達后（圖3A）可減少SOCE活性（圖3B）、STIM1和ORAI1的相互作用（圖3C）；同時也發現MHCC87H細胞的轉移能力被顯著抑制（圖3D）。STIM1高表達可增加SOCE的活性，進而促進肝癌細胞轉移。

2.4 STIM1在eHsp90α促進肝癌細胞轉移中的作用hrHsp90α處理的HepG2細胞STIM1表達顯著升高（圖4A），SOCE活性（圖4B）及STIM1和ORAI1的相互作用水平增加（圖4C），細胞轉移能力增強（圖4D）；而通過siRNA抑制STIM1增高后（圖4A），增加的SOCE活性（圖4B）及STIM1和ORAI1的相互作用水平被抑制（圖4C），增高的細胞轉移能力也被抑制（圖4D）。提示，eHsp90α通過上調STIM1表達促進肝癌細胞轉移。

3 討論

通過上述的研究發現肝癌細胞中eHsp90α較正常肝細胞顯著增加，并且高度轉移能力肝癌細胞中eHsp90α水平、STIM1蛋白表達和SOCE活性較低轉移能力肝癌細胞顯著升高。同時還發現eHsp90α通過增強SOCE活性促進肝癌細胞的轉移。

Hsp90是細胞內參與蛋白折疊和穩定的重要蛋白，大量的研究證明Hsp90在腫瘤細胞中表達增加，參了腫瘤的發生發展［11-12］。但因Hsp90在細胞正常生理中有重要作用，通過抑制Hsp90的活性來治療腫瘤的同時出現嚴重副作用［13-14］。而新近的研究發現，分泌到細胞外的Hsp90有Hsp90α和Hsp90β。DONG等［9］的研究報道顯示，細胞外的Hsp90α（即eHsp90α）有促進腫瘤轉移的作用。并且，eHsp90α在腫瘤細胞外大量存在，與腫瘤的轉移和侵襲密切相關［9-10］。本研究發現，在肝癌細胞系中eHsp90α較正常肝細胞系顯著增加；高轉移能力的MHCC87H和HCCLM3細胞中eHsp90α較低轉移能力的HepG2、HL-7702和SNU-449顯著升高。并且，用hrHsp90α誘導低轉移性的HepG2細胞可以增強其轉移能力。由此提示，eHsp90α可促進肝癌細胞的轉移。

圖2 激活的SOCE促進肝癌細胞轉移Fig.2 Activated SOCE promotes liver cancer cell metastasis

圖3 STIM1在肝癌細胞轉移中的作用Fig.3 The effect of STIM1 on hepatocellular carcinoma cells metastasis

圖4 STIM1在eHsp90α促進肝癌細胞轉移中的作用Fig.4 The role of STIM1 in eHsp90α promoting hepatoma cell metastasis

SOCE的細胞外鈣內流到細胞內的主要途徑，在乳腺癌［15-16］、肺癌［17］、骨肉瘤［18］、肝癌［19］等腫瘤中均證實SOCE參與腫瘤細胞的轉移和侵襲。通過對比低轉移能力的HepG2、HL-7702、SNU-449細胞和高轉移能力的MHCC87H、HCCLM3細胞的SOCE活性，本研究發現高轉移能力的MHCC87H、HCCLM3細胞的SOCE活性顯著高于低轉移能力的 HepG2、HL-7702、SNU-449細胞。并且，抑制SOCE的活性可以抑制MHCC87H的轉移能力。

SOCE主要由內質網上的STIM1蛋白激活細胞膜上的鈣離子通道ORAI1，誘導外鈣內流［20］。在高轉移能力的MHCC87H、HCCLM3細胞中，STIM1蛋白的表達較低轉移能力的HepG2、HL-7702、SNU-449細胞明顯增加，但高低轉移能力的肝癌細胞系中ORAI1蛋白表達沒有差異。SAINT［21］和吳冰［22］等也均發現STIM1蛋白高表達可促進腫瘤轉移。本研究進一步發現，敲低MHCC87H細胞STIM1蛋白表達后，其轉移能力明顯減弱。說明肝癌細胞中STIM1蛋白表達的差異導致SOCE活性的不同，進而影響肝癌細胞轉移能力。本研究也發現，在eHsp90α誘導的HepG2細胞中，其SOCE活性顯著增強，STIM1蛋白表達增多；但敲低增加的STIM1蛋白，eHsp90α誘導的HepG2細胞轉移能力增加的作用被抑制。

綜上所述，肝癌細胞通過大量分泌eHsp90α，誘導STIM1蛋白表達，增加SOCE活性，促進肝癌細胞的轉移。這對進一步了解肝癌細胞轉移的機制有一定的幫助。但eHsp90α是如何促進STIM1蛋白表達及SOCE激活后是如何促進肝癌細胞轉移的還需要進一步研究。