腸桿菌FM-1強化積雪草修復鎘污染土壤機理

于方明,余秋平,劉可慧,王 洋,周振明,陳朝述,李 藝*

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腸桿菌FM-1強化積雪草修復鎘污染土壤機理

于方明1,2,3,余秋平2,劉可慧3,4,王 洋2,周振明1,2,3,陳朝述1,2,3,李 藝1,2,3*

(1.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室,廣西 桂林 541004；2.廣西師范大學環(huán)境與資源學院,廣西 桂林 541004；3.巖溶生態(tài)與環(huán)境變化研究廣西高校重點實驗室,廣西 桂林 541004；4.廣西師范大學生命科學學院,廣西 桂林 541004)

分析了腸桿菌FM-1的耐鎘性及促生特性,并研究了腸桿菌FM-1對礦山型和非礦山型積雪草鎘富集及根際土壤pH值的影響.結(jié)果表明,腸桿菌FM-1對鎘有較強的耐受性,其分泌的吲哚乙酸含量,鐵載體/r值和溶磷能力分別達到(72.85±0.62)mg/L,0.21±0.01和(143.33±2.13)mg/L,表明腸桿菌FM-1具有良好的促生能力.將腸桿菌FM-1接種于采自廣西柳州泗頂鉛鋅礦周邊4種類型的土壤中,均不同程度提高了礦山型和非礦山型積雪草對鎘的富集.其中,下游區(qū)土壤接種腸桿菌FM-1后,礦山型積雪草莖和葉中鎘含量分別增加了87.90%~161.84%和21.85%~76.42%,非礦山型葉片中的鎘含量增加了5.84%~35.20%.研究表明腸桿菌FM-1促進了積雪草對鎘的富集.同時,腸桿菌FM-1的添加在一定程度上影響了積雪草根際土壤的pH值,顯著降低了下游區(qū)礦山型積雪草根際土壤中的pH值.

腸桿菌FM-1；積雪草；鎘；植物促生素

2014年國家環(huán)保部聯(lián)合國土資源部發(fā)布全國土壤污染調(diào)查報告,結(jié)果顯示全國土壤環(huán)境狀況不容樂觀,部分地區(qū)污染嚴重,其中,鎘已成為最主要的無機污染物之一.在眾多重金屬污染土壤修復生物方法中,微生物-植物聯(lián)合修復技術(shù)因其對環(huán)境友好成為目前的研究熱點.微生物中的植物促生菌(PGPB),通過分泌生長激素,如:吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、氨基環(huán)丙烷羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC)脫氫酶、鐵載體(siderophore)等,實現(xiàn)促進植物生長,增強植物對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用,從而達到提高修復土壤重金屬污染的目的[1-3].具有植物促生能力的微生物有很多種,包括慢生根瘤菌(),芽孢桿菌(sp.),假單胞菌(sp.),和腸桿菌(sp.)等[4-6].

微生物可以通過分泌鐵載體,提高植物對鐵的吸收和利用,且能與鋁、鋅和鉛等金屬形成穩(wěn)定的復合物[7].研究表明,在鎘的誘導下,sp. TISTR2221通過分泌吲哚乙酸促進大豆對土壤中鎘的富集[8];sp. EG16通過分泌吲哚乙酸和鐵載體促進植物生長[5];sp. MU1通過分泌吲哚乙酸來增加鎘的水溶性和生物可利用性,從而使其能夠更好的被向日葵富集[9].

在作者的前期研究中,從廣西柳州泗頂鉛鋅礦區(qū)鎘污染土壤中篩選得到一株耐鎘菌株——腸桿菌FM-1(sp. FM-1)及鎘超富集植物積雪草(L.)[10].但在當前的研究中還未發(fā)現(xiàn)利用腸桿菌-積雪草對鎘污染土壤進行聯(lián)合修復的研究.因此,本研究通過盆栽灌根的方式,研究了腸桿菌FM-1的促生特性及其對礦山型和非礦山型積雪草鎘吸收的影響,旨在為鎘污染土壤的植物-微生物聯(lián)合修復提供理論依據(jù)和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試菌株為腸桿菌FM-1(sp. FM-1),GenBank登錄號:MF664375;中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號:2017825.礦山型積雪草采自廣西柳州泗頂鉛鋅礦周邊(北緯24°46′~25°34′,東經(jīng)109°13′~109°47′),非礦山型積雪草采集廣西師范大學環(huán)境與資源學院樓前草地.

實驗土壤分別采自廣西柳州泗頂鉛鋅礦的上游區(qū),采礦區(qū),下游區(qū)和尾礦區(qū).土壤采集時先去除地表雜物,然后采用蛇形5點法采集0~20cm的土壤,混合均勻后,置于塑料袋中運回實驗室.土樣經(jīng)自然風干后,一部分過4mm篩;另一部分過0.149mm的尼龍篩備用.上游區(qū)土壤采自泗頂鉛鋅礦上游5km;采礦區(qū)和尾礦區(qū)土壤采自礦區(qū)開采礦區(qū)和尾礦區(qū);下游區(qū)土壤采自礦區(qū)下游2km.土壤的理化性質(zhì)見表1.

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)

1.2 培養(yǎng)基及相關(guān)溶液的配制

LB培養(yǎng)基:5.0g牛肉膏,10.0g蛋白胨,5.0g NaCl,去離子定容到1000mL,121℃高壓蒸汽滅菌20min.

選擇性LB培養(yǎng)基:將LB培養(yǎng)基置于121℃下高壓滅菌20min,在無菌條件下,加入一定量Cd2+溶液,使其達到預定濃度.

Pikovskaya培養(yǎng)基:10.0g蔗糖,0.1g NaCl, 3.0g Ca3(PO4)2, 3.0g (NH4)2SO4, 0.2g KCl, 0.1g MgSO4·7H2O,微量FeSO4·7H2O,微量MnSO4,去離子水定容到1000mL.

Salkowski試劑:將10mL0.5mol/L的FeCl3溶液與50mL35%的高氯酸混勻,避光保存.

吲哚乙酸標準溶液:稱取10.0mg吲哚乙酸,用乙醇溶解,去離子水定容至100mL作為儲備液.

CAS檢測液:取10.0mmol/L十六烷基三甲基溴化銨溶液6.0mL加入100mL容量瓶內(nèi)并用雙蒸水適度稀釋.將1.5mL 1mmol/L FeCl3溶液與7.5mL 2.0mmol/L鉻天青溶液混勻后,轉(zhuǎn)入至上述容量瓶中.稱取4.307g無水雙二甲胺,溶解于約30mL雙蒸水中,再加入6.25mL 12.0mol/LHC1,即得pH=5.6緩沖液,將此溶液轉(zhuǎn)入前述容量瓶中,去離子水定容至1000mL.

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1.3 實驗方法

1.3.1 鎘濃度對腸桿菌FM-1生長情況的影響將純化后得到的菌株,接種于LB液體培養(yǎng)基中

活化12h左右(OD600=1.0~1.2),然后以5%的接種量接入裝有95mL選擇性LB培養(yǎng)基(Cd2+濃度分別為0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0mmol/L)的三角瓶中,在30 ℃,150r/min下振蕩培養(yǎng),間隔時間取4mL發(fā)酵液,用紫外分光光度計在600nm處分析菌體密度(OD600).以培養(yǎng)時間為橫坐標,以O(shè)D600值為縱坐標,繪制菌體的生長曲線.

1.3.2 吲哚乙酸含量測定 吲哚乙酸含量采用Salkowski比色法測定.將供試菌株接入滅菌的LB液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中含有0.05%L-色氨酸),30℃恒溫搖床震蕩培養(yǎng)(150r/min)48h.取5mL發(fā)酵液8000r/min離心10min,取上清液1mL,加2mL Salkowski試劑充分混合,25℃條件下避光反應30min,測量其在530nm下的吸光值.以蒸餾水代替發(fā)酵液做空白對照調(diào)零.用純品吲哚乙酸配置標準溶液繪制標準曲線,根據(jù)發(fā)酵液的吸光值計算IAA濃度.

1.3.3 鐵載體測定將供試菌株接種于有氮液體培養(yǎng)基中,搖床30℃,150r/min振蕩培養(yǎng)48h.發(fā)酵液8000r/min離心10min,取上清液與等體積CAS檢測液充分混勻,顯色lh后測定630nm波長處的吸光值(),以去離子水作對照調(diào)零.按同樣方法,將等體積滅菌有氮液體培養(yǎng)基與CAS檢測液充分混勻,同法測定吸光值即為參比值(r).結(jié)果以/r值表示菌株產(chǎn)鐵載體的能力.

1.3.4 溶磷特性分析 將供試菌株接入LB液體培養(yǎng)基,30℃,150r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為1.0~1.2,吸取5mL菌懸液接種到100mL的含Ca3(PO4)2的Pikovskaya液體培養(yǎng)基中,30℃, 150r/min搖床培養(yǎng)72h,同時設(shè)不接菌對照.培養(yǎng)液在4℃,8000r/min下離心10min,上清液用于測定有效磷的含量.有效磷的測定采用鉬藍比色法測定[11].

1.3.5 植物栽培與微生物接種 將過4mm孔徑篩,且混合均勻的土壤分別裝入直徑為10cm的黑色塑料盆,每盆2.5kg.基肥標準:N 100mg/kg(以干土計,下同),以NH4NO3形式加入;P和K分別為80和100mg/kg,以KH2PO4形式加入,每30d施肥一次.選取生長一致的礦區(qū)和非礦區(qū)積雪草,栽入塑料盆中,每盆一株,定期澆水,保持水分為田間最大持水量的60%.在植物種植15d后,以灌根的形式分別向盆內(nèi)接種濃度為1.9×109,1.1×109和1.2×108CFU/mL的腸桿菌懸濁液30mL,每7d接種一次,以不加腸桿菌為對照,控制土壤中的腸桿菌濃度保持在1.14×108, 0.66×108和0.72×107CFU/g(土)左右.種植90d后采集植物和根際土壤樣品進行分析.

1.3.6 植物收獲與鎘含量測定 植株培養(yǎng)90d后,將植物從土壤中取出,用自來水沖洗干凈后,將根部放入20mmol/L的EDTA-Na2溶液中交換20min,用去離子水沖洗干凈.用吸水紙吸干表面水分,將根、莖和葉分開裝入信封,放在烘箱內(nèi),在105℃下殺青30min,且在70℃下烘干48h,至恒重,用不銹鋼粉碎機將植物樣品磨碎,用于測重金屬含量.根際土壤風干,過4mm篩,測定根際土壤的pH值.采用“抖根法”抖落大塊不含植物根系的土壤后,用刷子掃取根系表面的土壤,混勻作為根系土壤樣品進行分析[12].采用濕式消解法對植物根、莖和葉中重金屬含量進行消解,用原子吸收光譜儀進行測定[8].土壤pH值采用中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準(NY/T 1121.2-2006)的方法進行測定.

1.4 數(shù)據(jù)處理

文中所有實驗數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值,數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準誤差表示.采用Duncan多組極差檢驗對數(shù)據(jù)進行方差分析,其中,方差分析采用SPSS 19.0軟件完成;繪圖采用Excel 2010軟件完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 鎘對腸桿菌FM-1生長的影響

從圖1中可以看出,當發(fā)酵液中Cd2+濃度為0.5mmol/L時,菌株生長良好,生長速率與對照差異不明顯.當鎘濃度大于1.0moml/L時,Cd2+顯著影響了菌株的生長,表現(xiàn)為菌株生長的對數(shù)期的延長,達到穩(wěn)定期的時間比對照滯后了4h,但腸桿菌FM-1的生物量仍呈增加的趨勢.腸桿菌FM-1在Cd2+處理濃度為8.0mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后,其發(fā)酵液的OD600值依然保持在1.1左右,說明腸桿菌FM-1對鎘有較好的耐受性.

圖1 鎘對腸桿菌FM-1生長的影響

2.2 腸桿菌FM-1的植物促生特性分析

腸桿菌FM-1具有良好的植物促生能力;其中,吲哚乙酸的分泌達到(72.85±0.62)mg/L.產(chǎn)鐵載體能力的/r為0.21±0.01,溶磷能力為(143.33±2.13)mg/L.

He等[13]的研究表明sp.JN6具有良好的植物促生特性,菌株分泌的吲哚乙酸含量為19.8mg/L,表征產(chǎn)鐵載體能力的/r值為0.71,溶磷能力為133.54mg/L.Ma等[14]的研究表明,菌株E6S具有良好的植物促生能力,其產(chǎn)吲哚乙酸能力為19.8mg/L,溶磷能力為135mg/L.而腸桿菌FM-1分泌的吲哚乙酸含量為(72.85±0.62)mg/L,溶磷能力為(143.33±2.13)mg/L,這明顯高于sp.JN6和菌株E6S.另外,腸桿菌FM-1產(chǎn)鐵載體能力的/r值為(0.21±0.01),顯著低于sp.JN6的0.71.一般而言,產(chǎn)鐵載體能力的/r值越低,表示菌株的產(chǎn)鐵載體能力越強[15].因此,綜合上述分析,表明腸桿菌FM-1具有較強的植物促生特性.

2.3 腸桿菌FM-1對積雪草鎘富集的影響

(a) 非礦山型積雪草根、莖和葉中的鎘含量; (b) 礦山型積雪草根、莖和葉中的鎘含量不同小寫字母表示有顯著性差異

由圖2(a)可知,接種不同濃度的腸桿菌FM-1對采礦區(qū)和下游區(qū)非礦山型積雪草根、莖和葉中鎘含量增加明顯.在采礦區(qū)和下游區(qū)土壤中分別接種0.66×108和1.14×108CFU/g(土)的腸桿菌FM-1,根系中的鎘含量分別比對照提高了1.03倍和0.82倍.在采礦區(qū),接種1.14×108CFU/g(土)的腸桿菌FM-1,非礦山型積雪草莖中鎘含量最高,為299.12mg/kg,是對照的1.19倍.在下游區(qū)土壤接種濃度分別為0.72× 107,0.66×108和1.14×108CFU/g(土)的腸桿菌FM-1時,非礦山型積雪草根系中鎘含量分別比對照增加了37.43%,49.95%和130.59%.葉片中鎘含量則分別比對照增加了5.84%,20.02%和35.20%.在尾礦區(qū)土壤接種濃度分別為0.72×107,0.66×108和1.14× 108CFU/g(土)的腸桿菌FM-1時,非礦山型積雪草根、莖和葉中的鎘含量相對于對照都有不同程度的降低,這可能是由于尾礦區(qū)土壤中鎘的濃度較高,非礦山型積雪草的環(huán)境適應性較差,在高濃度鎘的環(huán)境下產(chǎn)生了中毒反應所導致的.

由圖2(b)可知,接種不同濃度的腸桿菌均對礦山型積雪草根,莖和葉中鎘含量有一定的影響.對于礦山型積雪草根系中,除上游區(qū)和下游區(qū)接種0.66×108CFU/g(土),采礦區(qū)接種1.14×108CFU/g(土)的腸桿菌FM-1后,鎘含量顯著高于對照外,其余與對照均無顯著性差異(>0.05).對于莖和葉中接種腸桿菌FM-1后,影響最為明顯的是下游區(qū)土壤.接種濃度分別為0.72×107, 0.66×108和1.14× 108CFU/g(土)腸桿菌后,礦山型積雪草莖中鎘含量分別比對照增加了87.90%,119.24%和161.84%;葉中則分別增加了21.85%,59.13%和76.42%,說明在土壤中接種腸桿菌FM-1有效促進了礦山型積雪草對鎘的吸收.

研究表明,在微生物-植物聯(lián)合修復體系中,微生物不僅可以改善植物根際環(huán)境,還可以通過分泌有機酸、基酸等物質(zhì),從而促進植物對重金屬的吸收[16-17].Chen等[18]通過向土壤中接種sp. Lk9后,龍葵(L.)中富集的鎘含量增加了17.4%.Ma等[19]通過向土壤中接種E2S2后,伴礦景天()中富集的鎘含量增加了43.0%.這與本研究中的結(jié)果相似.不僅如此,積雪草接種腸桿菌FM-1后,其莖中的鎘含量最高時比對照提高了161.84%,礦山型積雪草葉片中的鎘含量最高為381.29mg/kg,比對照提高了165.37mg/kg,這顯著高于sp. Lk9對龍葵以及E2S2對伴礦景天的促進作用.這可能與腸桿菌FM-1能分泌高濃度的吲哚乙酸和具有較強溶磷性等植物促生特性有關(guān).因為吲哚乙酸能增加鎘的水溶性,鐵載體能有效提高植物對鐵的吸收利用,在植物體內(nèi)可以與鎘形成較為穩(wěn)定的化合物[3,7].

2.4 腸桿菌FM-1對積雪草根際土壤pH值的影響

如表2所示,栽培非礦山型積雪草的土壤接種腸桿菌FM-1后,上游區(qū)土壤與對照間無顯著性差異(>0.05),采礦區(qū)土壤除接種0.66×108CFU/g(土)的pH值顯著低于對照外,其余均與對照無顯著性差異(0.05).在下游區(qū),接種0.66×108和1.14×108CFU/ g(土)的腸桿菌FM-1,根際土壤pH值比對照下降了0.10和0.15個單位,而尾礦區(qū)土壤則呈增加的變化趨勢.栽培礦山型積雪草的土壤接種腸桿菌FM-1后,根際土壤pH值變化最明顯的是采礦區(qū)土壤和下游區(qū)土壤.

在采礦區(qū)和下游區(qū)土壤中接種0.72×107, 0.66× 108和1.14×108CFU/g(土)腸桿菌FM-1后,采礦區(qū)土壤礦山型積雪草根際pH分別比對照下降了0.11,0.33和0.30,下游區(qū)土壤礦山型積雪草根際pH值則分別下降了0.53,0.48和0.33,且與對照差異顯著(<0.05).根際土壤pH值降低將提高土壤鎘的植物可利用態(tài).

表2 腸桿菌FM-1對積雪草根際土壤pH值的影響

注:同列不同小寫字母表示有顯著性差異.

Wang等[20]研究結(jié)果表明,根際土壤pH值降低,顯著提高了遏藍菜()對鎘的富集量.廉梅花等[21]的研究表明,根際土壤pH值降低至4.0,土壤中可利用鎘含量的比例增加至79.6%,顯著提高了垂盆草(Bunge)和東南景天(Hance)對鎘的富集量.本研究中,下游區(qū)土壤添加腸桿菌后,積雪草根莖葉中鎘含量增加最為明顯,這可能與根際土壤pH值降低提高了土壤鎘可溶態(tài),促進植物吸收有關(guān).

3 結(jié)論

3.1 腸桿菌FM-1對鎘的耐受性較好,在高濃度Cd2+存在的條件下依然可以正常生長.腸桿菌FM-1具有良好的植物促生性能,通過分泌吲哚乙酸增加鎘的水溶性;并能夠分泌鐵載體,提高植物對鐵的吸收利用.原菌的吲哚乙酸分泌量為(72.85±0.62)mg/L,產(chǎn)鐵載體能力的/r為0.21±0.01,溶磷能力為(143.33±2.13)mg/L.

3.2 接種不同濃度的腸桿菌FM-1于礦山型和非礦山型積雪草的根部,顯著提高了積雪草根、莖和葉中鎘含量(<0.05).并且,礦山型積雪草對鎘的吸收量要高于非礦山型積雪草;在相同的接菌量條件下,礦山型積雪草對鎘的富集濃度相對較高.

3.3 接種不同濃度的腸桿菌FM-1于礦山型和非礦山型積雪草的根部,顯著降低了下游區(qū)根際土壤的pH值(<0.05),表明腸桿菌FM-1與礦山型積雪草根際環(huán)境的形成,改變了植物根系的結(jié)構(gòu),使土壤的理化性質(zhì)發(fā)生改變,菌體的添加有效降低了土壤pH值,促進了積雪草對鎘的吸收.

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Improvement of cadmium-contaminated soil phytoremediation byL. through bioaugmentation ofsp. FM-1.

YU Fang-ming1,2,3, YU Qiu-ping2, LIU Ke-hui2,4, WANG Yang2, ZHOU Zhen-ming1,2,3, CHEN Chao-shu1,2,3, LI Yi1,2,3*

(1.Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection, Ministry of Education, Guilin 541004, China；2.College of Environment and Resource, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China；3.Key Laboratory of Karst Ecology and Environment Change of Guangxi Department of Education, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China；4.College of Life Science, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China)., 2018,38(12)：4625~4630

This study analyzed the bacteria tolerance to cadmium and plant growth-promoting substances produced bysp. FM-1. Also, examined the potential ofsp. FM-1 to assist in cadmium accumulation forL. and pH value in rhizosphere soil. The results indicated thatsp. FM-1had a relatively high cadmium tolerance. Also, the results showed that indole-3-acetic acid, siderophore parameter (/r) and soluble phosphate ability produced bysp. FM-1 were (72.85±0.62)mg/L, 0.21±0.01 and (143.33±2.13)mg/L, respectively, which indicated that bacteria had an excellent plant growth-promoting ability. Meanwhile, inoculation withsp. FM-1 in the four types of cadmium-contaminated soils which were collected in Siding lead-zinc mining area, increased the accumulation of cadmium in both two types ofL. in different degrees. For instance, inoculation withsp. FM-1 in the downstream area soil condition, the cadmium contents in the stems and leaves of mine-typeL. increased 87.90%~161.84% and 21.85%~76.42%, respectively. Meanwhile, the cadmium contents in the leaves of non-mine typeL. increased 5.84%~35.20%. Hence, inoculation withsp. FM-1 significantly increased the accumulation of cadmium inL. Furthermore, inoculation withsp. FM-1 had influenced the pH value in rhizosphere soil ofL. Especially for mine-typeL., pH value in rhizosphere soil of downstream area soil condition decreased significantly.

sp. FM-1；L.；cadmium；plant growth-promoting substances

X172

A

1000-6923(2018)12-4625-06

于方明(1975-),男,湖南綏寧人,教授,博士,主要從事環(huán)境污染生物修復研究.發(fā)表論文60余篇.

2018-05-02

國家自然科學基金資助項目(41661077);國家重點研發(fā)項目(2017YFD0801500);廣西創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展專項資金項目(桂科AA17204047-3);廣西自然科學基金青年基金資助項目(2017GXNSFBA198168)

* 責任作者, 講師, liyi412@mailbox.gxnu.edu.cn