分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定不同茶類中2,4-表蕓苔素內酯殘留

諸力，陳紅平，柴云峰，馬桂岑，郝振霞，王晨，劉新，魯成銀

農業農村部茶葉質量監督檢驗測試中心，中國農業科學院茶葉研究所，農業農村部茶葉產品質量安全風險評估實驗室（杭州），農業部茶葉質量安全控制重點實驗室，浙江 杭州 310008

蕓苔素內酯（Brassinolide）是一種高活性內源植物生長調節劑（Plant Growth Regulators,PGRs），最早從油菜素甾醇類化合物（Brassinosteroids，BRs）中分離得到，屬于內酯型甾體化合物[1]。由于其在天然植物內含量極低且提取工藝復雜，無法滿足實際生產需求，因此人工合成蕓苔素內酯成為趨勢。目前在我國已登記的4種合成蕓苔素內酯中，2,4-表蕓苔素內酯（2,4-Epibrassinolide，天豐素）以其合成效率高、成本低而應用最為廣泛[2]。一直以來蕓苔素內酯普遍應用于茶園生產領域，有研究表明其通過調節茶樹葉綠素及某些內源激素水平，能有效提升光合作用能力、促進細胞分裂，從而達到提高百芽重、增加產量及改善品質的目的[3-4]。然而隨著蕓苔素內酯等植物生長調節劑類農藥用量增多及使用范圍日益擴大，其安全性越來越受到關注，相關文獻報道指出，不同種類植物生長調節劑均具有生殖毒性[5]，部分還能夠增加腫瘤風險[6]和影響心肌功能[7]等。

目前，2,4-表蕓苔素內酯主要檢測方法包括液相色譜法[8-9]和質譜法[10-12]等，但絕大部分方法都需要經過傳統固相萃取、濃縮、衍生等，存在操作步驟繁瑣、抗干擾差、成本高等缺點。特別是茶葉具有典型基質效應[13-14]，其檢測前處理技術尤為關鍵，迄今尚未發現測定茶葉中2,4-表蕓苔素內酯相關研究報道。本文通過分散固相萃取前處理，省去濃縮、衍生等步驟，建立了一種超高效液相色譜-串聯質譜快速測定不同茶類中 2,4-表蕓苔素內酯的方法。該法靈敏、高效、穩定，可滿足各類茶葉檢測需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

茶葉樣品購置于浙江省各大茶葉市場。

標準樣品及試劑：2,4-表蕓苔素內酯（2,4-Epibrassinolide，CAS：78821-43-9 ）（純度不低于95.0%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Thermo Fisher Scientific公司）；甲酸銨（99.9%）、甲酸（95%）（德國Sigma公司）。C18鍵合鋯膠（Z-sep+）（美國Supelco公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、強陰離子交換劑（SAX）、強陽離子交換劑（SCX）（美國安捷倫科技有限公司）；C18、石墨化碳黑（GCB）（天津博納艾爾杰公司）。

儀器：AB Sciex TQ 5500型串聯三重四極桿質譜儀（美國Sciex公司）；LC-30A超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Mill-Q去離子水發生器（美國Millipore公司）；T10高速均質儀（德國IKA公司）；高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

茶葉樣品粉碎后過200 μm篩，稱取2.00 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩 1 min，18 000 r·min-1均質提取 2 min，10 000 r·min-1低溫離心 10 min（5℃），取上清液 1 mL 至裝有 100 mg C18、25 mg SAX和25 mg GCB吸附劑的2 mL離心管中，渦旋 1 min，10 000 r·min-1離心 5 min，上清液過 0.22 μm有機系濾膜，供液相色譜-串聯質譜分析。

1.2.2 色譜和質譜條件

色譜柱：Waters HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：含相同體積分數0.1%甲酸及1 mmol·L-1甲酸銨水溶液（流動相A）和甲醇溶液（流動相 B）；梯度洗脫程序：0～0.5 min，10%B；0.5～2 min，10%～98%B；2～5.5 min，98%B；5.5～5.51 min，98%～10%B；5.51～7 min，10%B；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：10.0 μL；柱溫：40℃；運行時間：7 min。

離子源：電噴霧離子源（ESI）正離子模式，溫度500 ℃，電壓 5 500 V；霧化氣（GS1）壓力：334.7 kPa；輔助氣（GS2）壓力：334.7 kPa；氣簾氣（Curtian Gas）壓力：241.3 kPa。定性、定量母子離子、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數見表1。

表1 2,4-表蕓苔素內酯的質譜條件參數Table 1 Mass spectrometric conditions for 2,4-epibrassinolide determination

1.2.3 標準曲線制作

稱取標準樣品0.05 g，用乙腈溶解并轉移至 50 mL容量瓶定容，配制成 1 000 mg·L-1標準溶液，4℃下冷藏保存待用。

標準曲線配制：不同茶樣空白樣品經1.2.1步驟處理后得到空白提取液，分別配制7個不同質量濃度 0.8、4、8、40、80、400、800 μg·L-1基質標準溶液，現配現用。

2 結果與分析

2.1 質譜和色譜條件優化

配制質量濃度 0.5 mg·L-1的 2,4-表蕓苔素內酯乙腈標準溶液經針泵注射進樣，在電噴霧正離子MRM模式下進行質譜測定條件優化，使目標化合物分子離子響應值達到最佳。通過Q1全掃模式得到化合物準分子離子峰[M+H]+m/z為 481.4，以其作為母離子進行二級裂解后得到4個靈敏度較高的碎片離子m/z分別為445.4、427.4、349.4、315.4。雖然母離子在丟失2個H2O（481.4→445.4）后得到的碎片離子的m/z為445.4時靈敏度最高，但在同等色譜條件下其信噪比（S/N）不及 m/z為 315.4的，因此選取m/z為481.4→315.4作為定量離子對。分子結構及碎片離子裂解途徑如圖1所示。

本研究采用的可編程多反應監測（Scheduled multiple reaction monitoring，SMRM）與較傳統MRM模式相比極大提高了單位檢測通量，可有效改善峰型，提高精密度和重現性[15]。

分別選用3種色譜柱（HSS T3，BEH C18，BEH C8）進行色譜條件優化，發現目標化合物在HSS T3柱上保留色譜峰型更佳且雜質干擾較小。流動相優化包括甲醇-水、甲醇-水（0.1%甲酸和 1 mmol·L-1甲酸銨）、甲醇-水（1 mmol·L-1甲酸銨）。結果表明，采用甲醇-水（0.1%甲酸和 1 mmol·L-1甲酸銨）作為流動相中的甲酸可提高[M+H]+化合物離子化效率，且緩沖體系可進一步增加系統穩定性[16]，故流動相采用甲醇-水（0.1%甲酸和1 mmol·L-1甲酸銨）。圖2給出8 μg·L-1綠茶基質標準溶液（A）、空白綠茶樣品溶液（B）、添標 40 μg·kg-1綠茶樣品溶液（C）中 2,4-表蕓苔素內酯二級質譜總離子流色譜圖。

2.2 前處理條件優化

分別選擇甲醇、乙腈[17]、乙腈/水（90/10、80/20、70/30、60/40、50/50，V/V）、乙腈/甲酸溶液（99/1，V/V）以及乙腈/水/甲酸溶液（80/19/1，V/V/V）進行提取效率優化。結果表明，隨著溶劑提取中含水比率越高，提取效果越不理想。原因可能是茶葉中強極性雜質共溶出導致產生較強基質效應（Matrix effect,Me）使離子化效率降低，從而導致質譜信號靈敏度下降。乙腈較甲醇極性更小，利于極性相對較弱的2,4-表蕓苔素內酯溶解。另外在提取過程中添加甲酸會導致提取效率下降9.5%，因此本研究選取乙腈作為提取溶劑。

圖1 2,4-表蕓苔素內酯的ESI質譜圖、分子結構及碎片離子裂解途徑Fig. 1 ESI mass spectrum, structure and fragmentation pathway of product ions of 2,4-epibrassinolide

圖2 8 μg·L-1綠茶基質標準溶液（A）、空白綠茶樣品溶液（B）、添標 40 μg·kg-1綠茶樣品溶液（C）中2,4-表蕓苔素內酯二級質譜總離子流圖Fig. 2 MS/MS total ions chromatogram of 2,4-epibrassinolide in 8 μg·L-1 matrix standard solution(A),blank solution(B) and 40 μg·kg-1 concentration levels(C) of green tea

凈化吸附劑條件優化，分別稱取25、50、100、200 mg的 6種吸附劑（PSA、SAX、SCX、C18、GCB、Z-sep+），各加入 1 mL質量濃度為100 μg·L-1基質標準溶液。凈化效果由R值表示，公式為%100/0×=SSR，其中S0為凈化前基質標樣峰面積，S為凈化后峰面積，R值越高表示經凈化后化合物信號越強，被吸附率越低，凈化效果越理想。試驗結果如圖3所示，PSA、SCX、Z-sep+對目標化合物產生較強吸附作用，R值偏低；SAX和GCB在低劑量時R值較高，而隨著劑量增大R值降低；C18具有強疏水特性，對脂肪酸等弱極性化合物具有較強吸附作用，在100 mg用量時R值達到最佳。因此本研究選擇100 mg C18、25 mg SAX和 25 mg GCB作為吸附劑凈化效果最佳，樣品經前處理后呈淺黃色透明狀。

2.3 線性范圍和方法定量限

采用1.2.3節中制備的各濃度基質標準溶液按優化后條件測定，以定量離子對峰面積對應濃度做標準曲線，得到不同茶類的茶基質中2,4-表蕓苔素內酯線性方程及其相關系數。結果表明（表2），綠茶、紅茶、白茶、黑茶、烏龍茶基質中，該化合物在 0.8～800 μg·L-1質量濃度范圍內線性良好（R2＞0.999）。以信噪比（S/N）計算方法定量限（LOQ，S/N=10）為 0.55～1.46 μg·kg-1。

2.4 回收率和精密度

取不同茶葉 2 g，分別添加 20、40、200 μg·kg-1標準樣品，按照前述方法處理平行測定6次，回收率和精密度詳見表2。不同茶類茶基質中目標化合物添標回收率范圍在75.5%～93.6%之間，RSD（n=6）值范圍在0.4%～7.0%之間，表明所建方法重復性良好。

2.5 基質效應評價

根據相應濃度乙腈溶劑標準樣品進行基質效應評價[18]，計算公式為：

圖3 不同吸附劑對2,4-表蕓苔素內酯吸附效果比較Fig. 3 Adsorption ability of different sorbents for 2,4-epibrassinolide with different levels

表2 不同茶類基質中2,4-表蕓苔素內酯線性方程、相關系數、添標回收率、精密度和方法定量限（n=6）Table 2 Linear equations, correlation coefficients, average recoveries, relative standard deviation (RSD), and limit of quantification(LOQ) of 2,4-epibrassinolide in different matrix(n=6)

kmatrix為基質標準曲線斜率，為乙腈溶劑標準曲線斜率。

結果表明不同茶類茶葉中化合物基質效應范圍在-16.4%～4.2%之間。為消除基質效應干擾，試驗采用相應基質匹配標樣進行校準。

2.6 實際樣品分析

運用此方法對市場78份樣品進行測試，所有茶樣均未檢出2,4-表蕓苔素內酯。

3 結論

本研究建立了適用于不同茶類中 2,4-表蕓苔素內酯測定的分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。本方法簡便快捷，靈敏精密，為我國茶葉行業中制定相關檢測標準提供了理論依據。