茶樹miR164a及其靶基因的鑒定與表達分析

孔雷，朱向向，王屹瑋，謝小芳，江昌俊，李葉云

安徽農業大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥，230036

MicroRNAs（miRNAs）是內源性單鏈非編碼小 RNA，在動物和植物中主要是在促進靶向 mRNA的剪切或翻譯抑制中起著重要的調節作用[1]。miR164家族是植物中廣泛存在的一類保守microRNA，近年來，關于miR164家族成員參與植物抗逆脅迫的報道越來越多[2]。miR164的表達具有組織及發育階段特異性，在植物細胞生長、組織發育、器官形成中起著重要的調控作用[3-4]。在擬南芥中，miR164在根部和花中的表達量比在葉片中的高[5]。在擬南芥和煙草花器官、分生組織以及原形成層中有miR164表達，且表達量較高[6]。在逆境脅迫條件下，植物miR164響應逆境脅迫，并且可能作為調控分子在防御系統中發揮著重要作用[3]。在非生物脅迫條件下，機械損傷會抑制毛果楊miR164的表達[7]，鹽脅迫和干旱脅迫處理會抑制甜楊幼苗 miR164的表達[8]。

植物 miR164調控的靶基因屬于植物NAC（NAM，ATAF1/2 和 CUC2）轉錄因子[3]。NAC轉錄因子是一個植物特有的轉錄因子家族[9-10]?？偟膩碚f，NAC蛋白的N端有由150個保守氨基酸組成的NAC結構域，C端有一個多樣化的轉錄調控區域[11]。近年來，NAC蛋白因其在植物生長發育和對環境適應的過程中發揮著多重作用而被深入研究[12]。NAC轉錄因子可以由轉錄水平上的某些順式作用元件和反式作用因子、轉錄后水平的 miRNA以及包括磷酸化、蛋白降解和二聚化的翻譯后調節水平調控[13]。許多NAC蛋白在非生物脅迫反應中發揮作用[14]。擬南芥ANAC019、055和072響應干旱、鹽和ABA等非生物脅迫[15]，擬南芥NAC轉錄因子LOV1響應冷脅迫[16]。過表達水稻SNAC1顯著提高轉基因水稻的抗旱性[17]。

研究表明，擬南芥 miR164家族（ath-miR164a、b和c）調控 5個 NAC轉錄因子基因（CUC1，CUC2，NACl，at5g07680，和at5g61430）的mRNA的降解是植物器官邊界建成、側根的產生、營養和花器官的形成以及與年齡相關的細胞死亡所需的[5,18-19]。小麥miR164和其靶基因 NAC（miR164-NAC）對干旱脅迫的響應呈負相關[20]。胡楊peu-miR164通過負調控PeNAC070來提高對干旱脅迫和鹽脅迫的耐受力[21]。

近年來，在茶樹抗逆分子機理研究中，茶樹中2個NAC轉錄因子獲得克隆，并響應溫度脅迫[22]，茶樹 miR164a也報道響應低溫脅迫[23-24]。但是茶樹miR164a與NAC轉錄因子家族中哪一個成員（miR164-NAC）存在調控關系以及如何響應逆境脅迫尚不清楚。本研究根據低溫脅迫下茶樹小RNA高通量測序結果獲得的茶樹miR164a，進行前體序列的克隆與分析；通過茶樹降解組測序獲得 miR164a靶基因，利用 RLM-5′RACE加以驗證，并對靶基因進行克隆與序列分析。探討茶樹miR164a及其靶基因在茶樹不同葉位、高溫脅迫和低溫脅迫中的表達模式，為揭示茶樹miR164a-NAC在茶樹生長發育、抗逆性中的作用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

以盆栽1年生無性系茶樹品種舒茶早（C.sinensiscv.Shuchazao）為試驗材料，溫度脅迫試驗在人工氣候室中進行[25]。選取芽、第1葉、第3葉、第5葉、第7葉，高溫脅迫處理溫度為白天38℃，晚上28℃，處理0、1、2、3、4 d（以處理0 d為對照）；低溫脅迫處理溫度為 4℃，處理 0、3、6、12、24 h（以處理0 h為對照），在各個時間點采集相同位置的葉片混樣，并迅速放入液氮中，儲存在-80℃冰箱備用[25]。

1.2 植物總RNA的提取

試驗材料經液氮研磨后，使用 miRcute miRNA提取分離試劑盒（TIANGEN，北京）提取茶樹總RNA。用核酸定量儀測定總RNA樣品的濃度、純度，用 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA樣品完整性，儲存在-80℃冰箱備用[25]。總 RNA反轉錄為 cDNA利用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，大連）試劑盒。

1.3 miR164a前體序列的克隆及其二級結構預測

使用植物MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit提取分離試劑盒（TaKaRa，大連）提取茶樹基因組 DNA，根據從本實驗室茶樹低溫miRNA高通量測序數據中得到的茶樹miR164a的前體基因序列：TCTAGATTCGT CGAACAGTAGGTGGGCAGCTCCTTGTTGG AGAAGCAGGGCACGTGCAAAAAGCTAAT GCTAGTAAGTTTTGTGTACGTGCTCCCCT TCTCCAACACGGGTTCCCTCACTCCCTCG ATTGCGAGCTC，用Primer 5軟件設計其特異性引物（表1）進行PCR擴增。利用RNAfold web server在線軟件（http://rna. tbi. univie.ac.at/cgi-bin/RNAWeb Suite/RNAfold.cgi）對 miR164a的前體序列進行二級結構的預測[26]。

1.4 利用降解組測序數據預測靶基因

降解組測序和預測工作由聯川生物公司（LC Bio Tech，杭州）完成，步驟如下：首先將測序獲得的原始數據通過一系列數據處理得到可用于后續分析的可比對測序序列，然后將可比對序列與測序物種茶樹的 cDNA數據庫序列比對生成降解組密度文件（Degradome density file），通過Targetfinder靶基因預測軟件預測出與測序物種茶樹小RNA序列配對的靶基因mRNA序列，最后將預測的miRNA對應的靶基因和生成降解組密度文件中的 mRNA進行結合運算，找出共同具有的mRNA，該mRNA即為miRNA的靶基因，并給出降解組的峰值分類和分值，并對產生的預測結果進行作圖（t-plots）[2]。

1.5 RLM-5′RACE驗證miR164a靶基因裂解位點

從降解組測序數據中獲知 gi319875685（NAC21/22）為miR164a的靶基因，根據從茶樹轉錄組中獲得的 gi319875685（NAC21/22）的基因序列片段，用 EditSeq和 MegAlign軟件查詢 ORF框，根據其 ORF兩端的序列設計RT-PCR引物（表1），測序驗證該序列的準確性。將獲得的cDNA序列在NCBI中進行BLASTn比對分析，結果顯示與公開的茶樹CsNAC1基因序列（GenBank:JN857066.1）相一致。

依據CsNAC1的 cDNA序列用 Primer Premier 5.0軟件設計用于RLM-5′RACE的引物（表1），RLM-5′RACE 試驗參照 5′-Full RACE試劑盒（TaKaRa，大連）說明書進行，將擴增出的特異產物進行克隆測序[2]。

1.6 靶基因CsNAC1序列生物信息學分析

用 EditSeq分析氨基酸序列。從 NCBI（https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）得到保守結構域，在 NCBI數據庫中分別用BLASTn和 BLASTx進行核酸序列及氨基酸序列比對分析，用 MAFFT version 7（ https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html）比對蛋白質的同源性序列，擬南芥、水稻 NAC家族轉錄因子基因序列的獲得以及NAC結構域和 miR164結合區域的確認參照文獻[21,27]，將序列用ClustalX比對后，利用MEGA 6.06軟件并通過鄰接（Neighborjoining）算法構建系統進化樹[25]。

1.7 茶樹miR164a及其靶基因在茶樹中的表達

根據從本實驗室茶樹低溫miRNA高通量測序數據中獲得的茶樹 miR164a成熟序列設計具有莖環結構的反轉錄引物，應用PrimerSelect軟件設計 miRNA上游引物[28]。利用 PrimeScriptTMRT reagent kit（TaKaRa，大連）進行反轉錄反應。熒光定量實驗參照SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒（TaKaRa，大連）說明書進行。pc-3p-222和CsEF-1α分別作為茶樹 miR164a qRT-PCR和靶基因CsNAC1qRT-PCR的內參基因[29-30]。采用CFX96TMReal-Time PCR Detection System擴增儀檢測，每個樣品3次生物學重復。驗證目標基因和內參基因的擴增效率和擴增范圍，采用法進行相對表達量的計算[25]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結果與分析

2.1 Csn-miR164a前體序列的克隆及其二級結構的預測

從本實驗室茶樹低溫 miRNA高通量測序數據中得到茶樹miR164a的前體序列，以茶樹總DNA為模板進行PCR擴增驗證，結果表明兩者序列完全一致，其長度為 126 bp（圖1）。Csn-miR164a前體序列的GC含量是53.97%，最小折疊自由能（Minimal folding free energies，MFE）為-65.60 kcal·mol-1，最小折疊自由能指數（Minimal folding free energies index，MEFi）為 0.96，MEFi大于 0.85，符合miRNA前體的特點[31]。RNAfold分析結果顯示，Csn-miR164a前體序列可折疊成較為典型的二級結構，其成熟片段位于前體結構的5′端莖結構上（圖2），其成熟序列為：5′-UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA-3′，21 bp，與miRbase 21數據庫中擬南芥、水稻和煙草等22個物種的miR164a成熟序列相一致。

2.2 茶樹Csn-miR164a靶基因的預測

將預測的Csn-miRNA164a對應的靶基因和生成降解組密度文件中的 mRNA進行結合運算，找出共同具有的mRNA（Gi319875685）。對產生的預測結果進行作圖（Target plot，t-plot），Alignment Score（Target finder的打分）為2、Alignment Range（配對作用位點）為631～651、Cleaveage Site（剪切位點）為 642、Category（分型）為 0、P-value（P值）為0.003 95、Rep_Norm_reads（匹配多位點迚行位點歸一化后的reads）為18.667。

在t-plot圖中，miRNA剪切靶基因mRNA的位點用箭頭標出，降解組測序預測的miR164a剪切位點位于靶基因mRNA的第642位核苷酸上（圖3）。

2.3 RLM-5′RACE驗證茶樹miR164a靶基因

利用RLM-5′RACE對降解組測序預測的茶樹 miR164a靶基因進行驗證，擴增出單一目的條帶（圖4），大小約為 231 bp，與預期的一致。為了準確驗證靶基因的裂解位點，挑取10個陽性克隆單菌落測序，測序結果全部顯示茶樹miR164a對靶基因的mRNA進行單一剪切，與 miR164a結合的區域為5′-AGCAAGUGCCCUGCUUCUCCA-3′ ， 剪切位點位于miRNA/target mRNA結合區域的第10位核苷酸上，第10位和第11位堿基之間，與降解組測序結果一致（圖5）。

圖1 Csn-miR164a前體序列的克隆電泳圖Fig. 1 Electrophoresis results of Csn-MIR164a cloning

圖2 Csn-miR164a前體二級結構預測Fig. 2 Predicted secondary stem-loop structure of Csn-MIR164a

圖3 利用降解組測序技術獲得茶樹miR164a靶基因的t-plot圖Fig. 3 Target plots (t-plots) of miR164a target confirmed by degradome sequencing in Camellia sinensis

2.4 Csn-miR164a靶基因全長ORF序列的驗證及其序列分析

從茶樹轉錄組中獲取個i319875685 mRNA序列，NCBI BLASTx比對顯示它具有完整的開放閱讀框（ORF）。設計引物擴增驗證其全長 ORF，PCR結果顯示擴增出的條帶大小與預期目的片段大小基本一致，約1 000 bp（圖6）。測序后，BLASTn分析表明，該序列與NCBI登錄的一個茶樹NAC1基因（登錄號：JN857066.1）的同源性達到99%。而與文獻報道的兩個茶樹NAC蛋白的同源性性分別只有30.26%和29.23%。該序列ORF長度為912 bp,編碼 303個氨基酸。保守結構域預測如圖7所示，CsNAC1中的第 33位至第 109位氨基酸序列為 NAM 超家族的保守結構域，這是NAC主要的特征功能域。

在NCBI數據庫中對CsNAC1氨基酸序列進行 BLASTx比對，結果顯示它與木豆（XP_020223961.1）的NAC21/22氨基酸序列相似性最高，為 73%，與毛果楊（XP_002310688.1）、野生大豆（KHN26800.1）的NAC相似性分別為72%、71%。

用MAFFT version 7對擬南芥、水稻和茶樹3種植物的14條NAC家族轉錄因子進行蛋白質序列分析，如圖8所示，這14條NAC家族轉錄因子的N端均有NAC結構域的5個亞結構域A—E，C端含有miR164的結合區域[21,27]。

選取20種不同植物中的NAC21/22構建進化樹分析，結果顯示，茶樹CsNAC1與藜麥（Chenopodium quinoa）NAC21/22的親緣關系最近（圖9）。

圖4 RLM-5′RACE擴增產物Fig. 4 PCR Production of RLM-5′RACE

圖5 miR164a靶基因裂解位點的驗證Fig. 5 Identification of cleavage sites of miR164a target

圖6 茶樹CsNAC1 ORF擴增產物電泳圖Fig. 6 The PCR product of CsNAC1 ORF in tea plant

圖7 CsNAC1的保守結構域Fig. 7 Conserved domain of CsNAC1 protein

圖8 茶樹、擬南芥和水稻miR164靶基因NAC的多序列比對Fig. 8 Multi-sequence alignments of the miR164 NAC target genes in tea plant, rice and Arabidopsis thaliana

圖9 茶樹CsNAC1的進化樹分析Fig. 9 Phylogenetic tree analysis of CsNAC1

2.4 茶樹miR164a和其靶基因CsNAC1表達模式分析

2.4.1 茶樹Csn-miR164a和CsNAC1在不同葉位中的表達分析

通過熒光定量PCR，檢測了Csn-miR164a及其靶基因CsNAC1在茶樹不同葉位的表達情況（圖10）。結果顯示，Csn-miR164a和CsNAC1在茶樹不同葉位的表達存在差異，Csn-miR164a在芽中的表達量最高，而靶基因CsNAC1在芽中的表達量最低。隨著葉片的發育，Csn-miR164a隨著葉位的降低表達量依次降低，在第7葉位（老葉）的表達量最低，僅為芽的47%。CsNAC1的表達量隨葉位的降低表達量逐漸增高，在第7葉位表達量最高，是芽的8倍?？梢?，Csn-miR164a隨著葉片的衰老表達量下降，而CsNAC1與Csn-miR164a呈現負相關，隨著葉片的衰老表達量增加。

2.4.2Csn-miR164a和CsNAC1對高溫脅迫的響應

從圖11可以看出，高溫誘導茶樹miR164a及其靶基因CsNAC1的表達。在脅迫處理的第1天高溫誘導miR164a的表達顯著下調，表達量為對照（0 d）的 58%，靶基因CsNAC1的表達量顯著上調，相對表達量是對照的3.5倍。miR164a表達量都在高溫脅迫處理的第4天達到最低，僅為對照的 46%，靶基因CsNAC1在第4天的表達量最高，是對照的6.6倍。在高溫脅迫處理下茶樹 miR164a的表達量隨脅迫處理時間的增加呈下調趨勢，而靶基因CsNAC1的表達量呈上調趨勢。茶樹在高溫脅迫處理下，靶基因CsNAC1的表達量與Csn-miR164a的表達量呈負相關。

2.4.3Csn-miR64a和CsNAC1對低溫脅迫的響應

如圖12所示，低溫誘導茶樹miR164a及其靶基因CsNAC1的表達，在低溫處理3 h后，Csn-miR164a的表達量顯著下調，僅為對照（0 h）的42%，CsNAC1上調表達，相對表達量是對照的5.7倍。在低溫處理24 h后，miR164a的表達量達到最低，相對表達量為對照的41%，而CsNAC1的表達量達到最高，相對表達量是對照的 20.3倍。在低溫脅迫處理下，靶基因CsNAC1的表達量與Csn-miR164a的表達量呈負相關。

3 討論

研究表明許多高度保守的miRNA響應逆境脅迫并有助于植物適應環境，miRNA靶基因大部分是轉錄因子，如AP2、NF-Y、MYB和NAC。植物miR164及其靶基因NAC基因在植物中是保守的，NAC蛋白代表一個植物特有的廣泛存在的轉錄因子家族，其調控植物的發育和應激反應[21]。在擬南芥中，miR164家族靶向7個NAC基因的轉錄物；在水稻中，miR164家族與6個NAC基因互補；在玉米中，發現7個NAC基因是預測的miR164的靶基因[21]。在茶樹中，初步發現NAC轉錄因子家族有45個成員[32]，然而本試驗僅發現與驗證一個 NAC轉錄因子為茶樹 miR164a的靶基因，是否還存在其它家族成員是 miR164a的靶基因，需要進一步研究。

圖10 Csn-miR164a和其靶基因CsNAC1在茶樹不同葉位中的表達分析Fig. 10 Expression analysis of Csn-miR164a and target gene CsNAC1 in different leaf position of tea plant

圖11 茶樹Csn-miR164a及其靶基因CsNAC1在高溫脅迫下的表達分析Fig. 11 Expression analysis of Csn-miR164a and target gene CsNAC1 in tea plant under heat stress

圖12 茶樹Csn-miR164a及其靶基因CsNAC1在低溫脅迫下的表達分析Fig. 12 Expression analysis of Csn-miR164a and target gene CsNAC1 in tea plant under cold stress

在水稻中，RLM-RACE分析顯示miR164定向剪切NAC轉錄因子家族成員OMTN1和OMTN2的剪切位點在第 10和 11位堿基之間[27]。在胡楊中，5′-RACE分析顯示miR164定向剪切PeNAC070、PeNAC012和PeNAC028mRNA，剪切位點在miR164第10和11位堿基之間[21]。在光皮樺中，運用5′-RACE驗證了NAC1為miR164靶基因，剪切位點也在第10和11位堿基之間[33]。在本研究中，我們通過降解組測序數據和RLM-5′-RACE驗證，獲知茶樹miR164a定向剪切CsNAC1，剪切位點同樣也在 miR164a第 10和 11位堿基之間。這表明miR164剪切位點可能是非常保守，沒有物種差異。

miR164表達的時序性和組織特異性可能決定了植物組織和細胞的功能特異性，對細胞生長和組織發育的調節起重要作用[3]。在擬南芥中，miR164隨著擬南芥葉片的衰老表達量下降[19]，甜菊新葉中miR164的表達量高于老葉[34]。在本研究中，隨著茶樹葉片的衰老，miR164表達量也呈下降趨勢，與其他植物一致，且Csn-miR164a與CsNAC1呈負相關關系，推測Csn-miR164a參與茶樹葉片生長發育過程，但是起何種作用尚不清楚。

植物miR164通過調控靶基因NAC轉錄因子參與植物抗逆脅迫[2]。對毛竹進行高溫（42℃）和低溫（4℃）處理，發現 miR164b的表達均呈現不同程度的下調，其靶基因PeNAC1上調表達[35]。對大豆進行低溫（4℃）處理，miR164也是下調表達[36]。與毛竹、大豆一致，茶樹Csn-miR164a低溫溫度下調表達，靶基因CsNAC1上調表達，呈負相關關系。但是 0℃低溫處理下甜楊幼苗、4℃低溫處理下小麥中 miR164a的表達均上調[37-38]，這表明不同物種miR164對低溫脅迫響應模式存在差異。

本研究初步揭示了Csn-miR164a-CsNAC1參與茶樹葉片的生長發育過程和響應溫度脅迫。但是，茶樹miR164a功能與作用仍需通過過表達轉基因等手段進一步的研究，miR164a-NAC1通過何種調控途徑來響應溫度脅迫，提高茶樹抗逆性的分子機制也有待深入研究。