誘導多能干細胞誘導與應用前景

李奧哲

【摘 要】誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells， iPSCs）于2006年被Yamanaka等人發現后，一度成為研究熱點。由于iPSC細胞具有類似于胚胎干細胞的增殖潛力與分化能力，且能夠通過重編程體細胞來獲得，因而相比于胚胎干細胞具有極大的應用潛力與優勢。此外，在臨床治療中，誘導多能干細胞能夠完成多種細胞類型的分化，甚至可以再生組織器官，因而對于目前較難治愈的某些器官病變疾病有顯著的療效。本文將從誘導多能干細胞概述、分子機制、誘導手段、成果應用以及目前遇到的困難進行簡要介紹。

【關鍵詞】 iPSCs；分子機制；重編程；細胞治療

【中圖分類號】R181.3+2 【文獻標志碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）17-291-01

1 iPS細胞概述

體細胞可以重新編程到多能狀態下的發現使干細胞研究的前景發生了深刻的改變。這種可以分化的細胞可以通過將核的內容信息轉移到卵母細胞或與胚胎干細胞融合而重新編程到胚胎狀態從而實現多潛能，讓普通體細胞“初始化”，使其具備再造干細胞功能，這就是“iPS細胞”。“iPS細胞”具有和胚胎干細胞類似的功能，這種重新編程的原理不僅避免了使用胚胎收集和培養ESCs的必要性，而且還帶來了避免移植排斥和移植物抗宿主病等免疫問題的額外預期優勢。因為最初的實驗證明小鼠和人類（成纖維細胞可以被重新編程通過病毒特異性過表達成為誘導多能干細胞（iPSCs）轉錄因子，許多方法已經被發展來產生iPSCs。這些方法可提高重編程細胞的效率和產生無足跡的iPSC，它們是沒有整合任何病毒載體序列基因組，然后通過將基因組進行分析和探索得出目的。下文將回顧iPSC信號通路和重新編程方法的當前狀態，集中于關注人類細胞的重新編程的各種措施，也會相應的提到對于小鼠細胞和其他更多的重新編程的方法手段。

2 iPS細胞分子機制

獲得iPS細胞中最重要的步驟就是體細胞重編程，其中牽涉到的遺傳因子有上文提到的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc以外，還有Nanog、Lin28等。在Takahashi和Yamanaka的研究中已經證明了重編程過程中可以不需要Nanog、Lin28。雖然Nanog對于維持胚胎干細胞多能性并不是不可或缺的，但因其能夠阻礙分化，所以仍是重編程過程中的一個重要因子（ 。在同樣的研究中，Silva等人發現Nanog能夠作為一個分子開關從而調控哺乳動物細胞中一些多能性源序列表達[1]。至于c-Myc因子則不同于以上提到的所有因子，由于它在重編程的最后步驟中不回上調多能性基因網絡的表達，因而它也不是必需的。c-Myc主要作用在于提高重編程過程的效率與動力學速率。而在后續的研究中發現Oct4作為核心轉錄調節回路最后一個因子也是重編程中最重要的因子（Walia， Satija et al. 2012）。但同樣有研究表明，一種叫做肝臟受體同系物-1（LRH-1）可以取代Oct4，并且能夠提高重編程的效率（Heng， Feng et al. 2010）。

關于iPS細胞中信號通路的研究目前證明有以下四種：Wnt通路，TGF-β通路，p53通路與BMP通路。下面我們通路來分別進行簡要介紹前三種通路。

Wnt通路中發現被稱為BIO的糖原合成激酶-3抑制因子作為Wnt通路下游效應因子能夠維持人類和小鼠胚胎干細胞的多能性（Sato， Meijer et al. 2004）。而另一種GSK3抑制劑CHIR999021則證明能夠彌補人類iPS細胞中Sox2缺失的情況。根據以上的研究推測，Wnt通路可以通過產生GSK3抑制因子來維持干細胞特性。其他研究則發現Oct4與Wnt/β-鏈蛋白通路能夠聯合作用從而調節Wnt信號來維持干細胞特性并決定細胞命運。

TGF-β通路在目前是研究的熱點、重點，研究發現TGF-β主要在維持干細胞多能狀態中起到重要作用。TGF-β/激活素通路能夠促進人類胚胎干細胞的增殖與自我更新。前文提到的Nanog因子更是TGF-β/激活素通路的直接調節目標，其中的具體調節機制已經證明是Smad共激活因子與Nanog近端啟動子結合，從而使得Nanog表達上調。雖然也有研究發現使用TGF-β受體/Alk5激酶抑制劑抑制TGF-β通路之后反而增強了小鼠iPS細胞重編程的效率，并且該抑制劑也能夠替代Sox2和c-Myc因子。但是在人類iPS細胞中并沒有發現同樣的結論。可以看出抑制TGF-β通路所產生的效應較為復雜，并且相關研究并不能得出統一結論，所以還有待進一步研究證明該通路作用機理與明確作用效果。

p53作為研究最深入的抑癌因子之一，在調節體細胞重編程過程中有著重要的保護作用。p53-p21通路除了在腫瘤形成過程中有阻礙作用，在iPS細胞生成中同樣有著抑制過度增殖的保護作用。另有研究表明大多數沒有敲除p53的細胞能夠通過重編程成為iPS細胞或者成為永生性細胞（Hanna， Saha et al. 2009）。而單細胞水平檢測發現敲低p53之后的大部分細胞脫離重編程路徑，最終整體重編程效率較低。因而有研究認為未來效率更高的重編程應該著重選擇p53略低且增殖能力更強的細胞，而不能完全沉默p53通路。

3 iPS細胞誘導手段

3.1 嘗試誘導小鼠的IPSC Takahashi和Yamanaka研究表明，完全表達已定義的轉錄因子也能將細胞（或細胞核）轉化為多能狀態。在ESCs中維持多能性的因素可能在體細胞中誘導多能性。為了探明因素的作用，他們測試了24個轉錄因子在mESC中的重要作用。他們通過逆轉錄病毒轉導將這些基因的組合導入小鼠成纖維細胞。這些細胞攜帶了一種耐抗生素基因，這種基因由β-半乳糖苷酶與新霉素的融合蛋白組成，它只有在F-box蛋白15基因（Fboxo15）被激活時才會表達，在表達后使用G418對融合蛋白進行篩選。他們設計了這個實驗，通過逐步排查，最后他們發現只有四種因素足以產生類似于ESC的菌落。基因組合為Oct3/4，Sox2， Klf4， c-Myc。這些重編程細胞被命名為誘導多能干細胞（iPSCs）。

3.2 Cre-Lox轉基因敲除介導的單個盒式重編程載體 由于慢病毒能夠感染不分裂和增殖的細胞，因而它成為體細胞表達重編程因子更好的運載體。但是這種方法有兩種弊端，一是其效率達不到使用要求，二是存在慢病毒的載體可能整合進入iPS細胞的基因組中的風險。為解決這些弊端，研究采用開發一種單個盒式重編程載體，并在其中每個重編程因子能夠彼此分開[2]，以自切肽信號的形式分布到每個載體中。這些載體中一部分就是構建LoxP位點，以此通過Cre重組酶的過表達來切斷任何連續整合的序列。

3.3 非病毒重編程方法

3.3.1 mRNA轉染 通過轉染mRNA的方式使受體細胞表達重編程因子同樣是一種無足跡制備iPS細胞的方法。有研究通過此方法在轉染20天內人成纖維細胞重編程效率達到1.4%（Warren， Manos et al. 2010）。在此基礎上，將Lin28因子、丙戊酸加入到Yamanaka重編程方案中，在O2下培養，重編程效率可以提高到4.4%。盡管重編程因子的mRNA能夠買到，且效率較高，但目前除成纖維細胞以外并沒有成功的案例。

3.3.2 miRNA感染/轉染 在胚胎干細胞中有幾個miRNA簇得到強烈表達。當miR-302b和miR-372加上四種慢病毒Yamanaka因子合成模擬物添加到MRC5和BJ-1成纖維細胞后重編程效率比只加入四種慢病毒因子提高10-15倍（Subramanyam， Lamouille et al. 2011）。而某些miRNA同樣能夠在沒有Yamanaka因子時仍舊能維持高效重編程人類細胞。只使用miR302/367的種子序列在轉染12-14天后仍大約有10%的BJ-1成纖維細胞產生iPSC（Anokye-Danso， Trivedi et al. 2011）。

3.4 卵母細胞重編程 體細胞基因組通過轉移進去核卵母細胞中能夠迅速得到重編程，作為iPS細胞的一種替代技術。這種技術在包括小鼠在內的數種物種中效率幾乎是100%。然而，限于倫理與部分技術原因，這項技術在人類中并沒有得到很好的實施。有研究通過成纖維細胞核轉移到未去除細胞核的卵母細胞中進行重編程從而得到了目的細胞。這種方法得到的重編程細胞與iPS細胞的表達譜與表觀遺傳學標記都十分相似。由于重編程的細胞是三倍體，所以不能用于臨床治療，只能用于科學研究，也因此得以進行。目前該方法受限于倫理難以開展，所以仍需進行技術改進，尋找符合倫理道德的類卵母細胞載體。

4 iPS細胞的應用

科學研究方面，iPS細胞能夠作為研究發育中特定時期的特定分子機制研究提供實驗材料，在不違背倫理道德的基礎上開展更深層次的發源發育研究。同時也能夠為研究病理機制、藥物作用等臨床研究提供基本的實驗基礎，為臨床科研的發展做出巨大的推動。

臨床應用方面，iPS細胞能夠在特定條件下培養形成擬胚體（EB）結構，并可以在EB結構的基礎上通過不同因子誘導分化形成不同類型的功能性細胞，例如造血干細胞（Raya， Rodriguez-Piza et al. 2009）、胰島B細胞（Maehr， Chen et al. 2009）、運動神經元（Dimos， Rodolfa et al. 2008）等。iPS細胞的主要應用方式有兩種，一方面通過誘導形成正常細胞、組織從而替代病變損傷的細胞、組織，達到治愈目的，另一方面通過誘導形成的正常功能細胞，分泌相應物質，如黑色素等，治療相應疾病。

這種治療手段是細胞治療中極具前景的方法之一，既不受限于倫理、道德、法律，又可以避免免疫排斥等問題，而且能夠治療很多目前醫療手段無法治愈的遺傳疾病、神經系統疾病等疑難雜癥。

5 iPS細胞應用中的困難

iPS 細胞的出現不僅僅因為它能避免人體胚胎克隆技術引發的倫理爭議，更由于它突破了以往只能利用卵子和胚胎的取材限制，其高效、便利為再生醫學應用打開了大門，為未來干細胞用于個體治療帶來了希望，其應用價值十分令人期待， 但在應用于人體細胞移植或藥物研究領域還面臨很多問題有待解決。

5.1 致癌風險 這是制約 iPS 細胞在多個醫療應用的首要因素.在培育iPS細胞時，需要依靠逆轉錄酶病毒或慢病毒將這4個（Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4）基因導入體細胞，而使用病毒載體有可能引發腫瘤形成，因其利用病毒誘導得到的 iPS 細胞基因組中整合了用于重編程的基因， 并能在之后的分化過程中穩定存在， 增加了患癌的風險。此外，每次實驗前都要制作新的病毒載體，對操作過程時間的把控和實驗室的管理要求嚴格。因此， 需要在提高安全性的同時， 同時還要高效地獲得臨床級別的患者特異性 iPS細胞，這些問題的難度都阻礙著iPS細胞技術的普及與在醫學上的應用。

5.2 轉化機制的未知性 iPS 細胞的再分化機制還不明確， 人類仍不能按照自己的意愿將其定向分化為所需的細胞.正因如此，我們需去更深入的探索如何確保分化后的功能細胞移植后能穩定地發揮功效而不會違反意愿產生了不必要甚至具有危害作用的副作用。通過對其機制的充分研究明確清楚對于iPSCs 和成體細胞之間轉變的機制， 以及重編程過程又是如何發生的。因此， 需要進一步深入研究 iPS 細胞定向分化的分子機理，從機制入手解決各類實際問題。

5.3 iPS細胞產生速率緩慢且功能效率低 通過提高 iPS 細胞的分化效率， 從而高效地獲得所需的功能性細胞，這是目前對于iPS細胞去投入實際應用的一大具體的問題，在研究過程中發現一些手段我們可以提高速率，但是要進入實際不僅是運用藥劑成本的高低問題，還包括了脫離實驗室后能否切實的產生預期的目的，這都是需要時間與物力人力的檢驗。再當發現能夠解決這個問題的方法之后我們才能進入理論上對于iPS細胞的預期實踐，而使iPS細胞在現代醫學存在一席之地。

以上都證明iPS細胞的應用方面還存在很多的疑惑與困難，相信在未來隨著研究水平不斷提高，相關領域的深度、廣度不斷增加，相關臨床實驗的不斷開展，人們終有一天能夠享受到誘導多能干細胞為健康生活創造的巨大福利。

參考文獻

[1] 夏朦， 侯偉健， 柏樹令，等. 誘導多能干細胞的研究進展[J]. 中國民康醫學， 2015， 26（14）：165-169.

[2] 劉國強， 洪天配. 誘導性多潛能干細胞的研究進展和應用前景[J]. 世界華人消化雜志， 2008， 16（12）：1255-1259.