冠心病相關基因的生物信息學分析

吳家炎 袁振光 陳依敏

【摘 要】 目的：采用生物信息學的方法來分析冠心病相關的基因，通路，轉錄因子和miRNA。方法：從公共基因芯片數據庫GEO下載冠心病基因表達譜數據，篩選出差異表達基因（DEGs），并對差異基因進行GO、KEGG以及PPI網絡分析。最后利用Webgestalt預測CHD相關的miRNA以及轉錄因子，并構建miRNA-TF-gene調控網絡。結果：共篩選出1449個DEGs。GO功能分析發現DEGs主要參與炎癥反應、細胞 - 細胞信號傳導、神經肽信號通路等生物學過程。KEGG通路富集分析發現DEGs參與神經活性配體 - 受體相互作用、蛋白質的消化和吸收、維生素的消化吸收等通路。并且篩選出20個與冠心病發病相關的基因，特別是發現了少有文獻報道的POMC、MYOD1等基因。最后我們還預測了與CHD相關的7個轉錄因子和3個miRNA。結論：通過生物信息學對基因芯片數據的分析，我們得到了冠心病相關的基因、通路、miRNA以及轉錄因子，為冠心病的精準治療提供了新思路。

【關鍵詞】 冠心病；生物信息學；差異表達基因 ；miRNA；轉錄因子

【中圖分類號】 R249 【文獻標志碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）17-001-01

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary heart disease，CHD） 是由于冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞導致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，簡稱為冠心病，是 21 世紀威脅人類健康的主要疾病之一 [1]。冠心病的發生和發展是在遺傳因素和環境因素基礎上，多重危險因素共同作用導致的[2]。高血壓、糖尿病等疾病，以及過度肥胖、不良生活習慣如吸煙等是誘發該病的主要因素。冠心病是全球死亡率最高的疾病之一[3]，目前對冠心病發病的遺傳因素還不清楚，對其基因方面的研究相對不足。

近年來，生物信息學發展迅速，為疾病在基因方面的研究提供了非常廣闊的平臺。生物信息學（Bioinformatics）是在生命科學的研究中，以計算機為工具對生物信息進行儲存、檢索和分析的科學。它是當今生命科學和自然科學的重大前沿領域之一，同時也是21世紀自然科學的核心領域之一。本文從GEO 數據庫下載冠心病相關基因表達譜數據，為在基因層次上研究冠心病的發生發展及其精準治療提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源 利用美國國立生物技術信息中心NCBI平 臺 下 的GEO 數據庫進行芯片篩選，目標芯片需滿足如下篩選標準：①人類標本，排除細胞株和動物；②入選芯片需具有冠心病信息；③需為基因表達芯片，各探針具有歸一化的表達值； 經篩選及芯片質量分析，我們選取了6個樣本：冠心病CHD3例和健康對照組3例。

1.2 方法

1.2.1 差異基因篩選 下載CEL格式原始數據，利用R軟件包affy進行讀取，采用RMA方法進行數據標準化預處理（包括Background correction， Normalization， Expression calculation），利用平臺注釋文件對探針進行注釋，去除沒有匹配到基因的探針；對于不同探針映射到同一基因，我們取不同探針的均值作為這個基因最終的表達值。基于R包limma篩選差異表達基因，采用矯正T檢驗計算基因表達顯著性P值，BH方法矯正P值。每個差異表達基因，要求P<0.05。

1.2.2 差異表達基因功能分析 使用常用的富集分析工具DAVID分析差異表達基因參與的GO（gene ontology） 功能和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes） 通路。參數富集基因個數count>=2，超幾何檢驗顯著性閾值P <0.05。

1.2.3 差異表達基因的PPI網絡分析 使用STRING數據庫預測分析所有差異表達基因的差異蛋白的PPI網絡，PPI網絡可揭示蛋白之間的互作關系。構建網絡軟件為Cytoscape。并統計節點degree值，觀察節點之間的連接情況。

1.2.4 miRNA-TF-gene調控網絡 利用webgestalt網站分別對差異基因進行轉錄因子TF富集預測和miRNA富集預測。取富集結果顯著的TF和miRNA。并整理TF-gene和miRNA-gene關系對，構建miRNA-TF-gene調控網絡。

2 結果

2.1 差異表達基因篩選結果 最終我們共篩選出1449個差異基因，與對照組相比，冠心病樣品組得到726個上調基因，723個下調基因。

2.2 GO功能和KEGG通路富集分析 通過G0功能分類體系對差異基因進行注釋后發現，顯著富集的生物過程GO富集分析發現DEGs主要參與炎癥反應、細胞-細胞信號轉導、

神經肽信號通路、G蛋白偶聯受體-環核苷酸通路、G蛋白偶聯受體-蛋白信號通路的正調控等生物學過程。以KEGG數據庫中的pathway為基本單位，向背景基因組映射，明確差異基因所參與的主要代謝途徑和細胞轉導通路，結果表明差異基因顯著富集于神經活性配體-受體相互作用、蛋白質的消化和吸收、黑素瘤、維生素的消化吸收、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、脂肪的消化吸收等具有統計學意義的通路。

2.3 PPI網絡分析 結合PPI數據庫，分別對上調差異基因和下調差異基因構建網絡圖，得到的PPI網絡。上調ppi網絡包括392個節點，下調ppi網絡包括419個節點。上調基因按照節點度大小排名的top 20 ，見表1。此處插入表12.4 miRNA-TF-gene調控網絡：通過Webgestalt，我們找到富集結果排名前七的轉錄因子TF：PAX8、EVI1、AR、NRSF、GATA、IK1、MYOD，以及排名前三的miRNA：MIR-26A/B，MIR-29A/B/C，MIR-122A。整理相應的TF和miRNA的靶基因，構建miRNA-TF-gene調控網絡，見圖1。

3 討論

目前對冠心病的發病機制，還不是特別的清楚。根據文獻報道，炎癥反應對冠狀動脈形成粥樣硬化具有重要的作用。Luczak[4]FanWH[5]楊海燕[6]等研究表明，慢性炎癥反應導致細胞產生黏附分子，是動脈粥樣硬化的始動環節；同時炎癥指標可用來預測心血管疾病的發生。但是目前在基因水平上對該病的了解還是非常的有限，因此本研究對正常人和冠心病患者的表達譜進行差異基因篩選，共篩選出1449個差異基因。利用string 在線軟件對1449個差異基因編碼蛋白進行蛋白質互相作用關系網絡分析，按節點度大小篩選出排名前20的上調基因：POMC、FPR2、MYOD1、GATA1、C3、GRM4、DRD4、SSTR5、PYY、FGF13、RGS6、CXCR1、、CCR10、SSTR4、CNR2、GALR3、APLN、NPBWR1、CDX2、PTGDR2。

對以上基因進行文獻挖掘，我們發現已有大量的文獻報道APLN、CXCR1、C3、FPR2與冠心病的發生、發展的機制以及預后關系密切 ；NR2、PYY、NPBWR1、PTGDR2與冠心病發生的危險因素有關，比如：糖尿病、高血壓、肥胖；POMC、MYOD1等至今少有跟冠心病相關的報道。Guang Yang等研究表明，載脂蛋白C3單核苷酸多態性增加了冠心病的發生風險[7] ；Ye zhang等認為CXCR1通過抑制內皮細胞轉移，使冠心病發生的風險增加[8]；CAPLN是APJ受體的內源性肽配體，已經成為心血管系統的新型調節劑，APLN的缺乏使血管和內皮祖細胞生成減少，從而體內心肌血管生成受損，同時也會增加對缺血性損傷的易感性，這也增加了冠心病發作的風險[9]。值得一提的是，我們發現POMC、MYOD1等基因與冠心病之間的關系報道較少。MyoD1基因，別名MYF3，是一種蛋白質編碼基因。Davis等人在1987年通過與小鼠MyoD1探針的弱交叉雜交分離出3種不同的人肌源性因子MYF3，MYF4和MYF5的cDNA，證明MYF3是小鼠MyoD1的人類同系物。Weintraub等人在1991年研究發現MyoD1僅在骨骼肌及其前體中表達，在非肌肉細胞中，基因被特定基因所抑制。但這與冠心病的發生發展還需進一步的研究。

值得一提是，我們還利用Webgestalt和Cytoscape構建了miRNA-TF-gene調控網絡。Webgestalt的富集結果中，我們得到與CHD關系最為密切的7個轉錄因子：PAX8、EVI1、AR、NRSF、GATA、IK1、MYOD，以及3個miRNA：MIR-26A/B，MIR-29A/B/C，MIR-122A。

總之，通過生物信息學方法對冠心病芯片進行數據挖掘，我們得到了冠心病患者和正常健康人之間的差異表達基因。對這些差異表達基因的進一步篩選得到包括MYOD1和POMC在內的20個關鍵基因；同時我們發現炎癥反應、維生素的消化吸收等過程和神經活性配體 - 受體相互作用等通路；最后我們進一步研究發現了一些與CHD相關的轉錄因子和miRNA：PAX8、EVI1、AR、MIR-26A/B、MIR-29A/B/C，MIR-122A。這些基因，轉錄因子和miRNA可能在CHD的發病機制中發揮重要的作用，但是具體的作用機制還需要進一步的實驗來探討，這對于CHD以后的精準治療具有一定的臨床意義

參考文獻

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