紫草素逆轉人肺腺癌順鉑耐藥的實驗研究

周 娟，鐘詢龍，黃素超，鄭宏明，盧琳琳

(1.廣州醫科大學附屬第二醫院藥學部，廣州 510260；2.廣州中醫藥大學國際中醫藥轉化醫學研究所，廣州 510006)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，以順鉑(DDP)為代表的鉑類聯合其他化療藥是臨床治療肺癌的一線方案[1]，多數患者在化療初期對藥物敏感，表現為腫瘤體積縮小，臨床癥狀明顯減輕，但后期效果不佳，腫瘤細胞的多藥耐藥性是導致肺癌化療失敗的主要原因之一[2]。因此，臨床迫切需要能逆轉腫瘤細胞耐藥的藥物。

紫草為紫草科植物新疆紫草或內蒙紫草的干燥根，是我國常用中藥材，味甘、咸，性寒，歸心、肝經，具有清熱涼血，活血解毒，透疹消斑等功效[3]。紫草素(Shikonin，SHK) 是一種萘醌類化合物，為紫草的主要有效成分之一，紫草素具有抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、加速傷口愈合和增強免疫等功效[4]。目前，紫草素的抗腫瘤作用是研究的熱點，紫草素可以通過抑制腫瘤細胞增殖，改變細胞周期，并誘導細胞凋亡等途徑對多種腫瘤細胞產生作用[5]。研究表明紫草素可以顯著抑制肺腺癌A549細胞增殖，誘導細胞凋亡[6-7]，但紫草素對肺癌順鉑耐藥的影響報道相對較少，本研究通過體內體外兩方面考察紫草素對人肺腺癌順鉑耐藥的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗動物

A549細胞、A549/DDP來源于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。SPF級BALB/c-nude雌性小鼠(46周，16～20 g)，購買于中山大學動物實驗中心[許可證號：SCXK(粵)2016-0029]，飼養于廣州中醫藥大學國際中醫藥轉化醫學院研究所SPF級實驗動物中心[許可證號：SYXK (GZ) 2014-0144]。

1.2 儀器與試劑

紫草素購自成都曼思特生物科技有限公司，純度大于或等于98%；順鉑購自山東齊魯制藥；環磷酰胺、MTT、玉米油購自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 A549、A549/DDP細胞用含10%FBS和1%雙抗的RPMI-1640完全培養基培養，置于5%CO2、37 ℃飽和濕度恒溫培養箱中常規培養，隔天更換培養基。

1.3.2MTT法檢測紫草素對A549、A549/DDP細胞毒性影響

1.3.2.1細胞準備 取生長狀態良好的細胞胰酶消化、離心、加培養基混勻，按每孔2 000個細胞，把細胞接種到96孔板中，置培養箱中培養過夜，待細胞生長狀態恢復后，再進行實驗。

1.3.2.2設計藥物濃度 紫草素按0、1、2、4、6 μmol/L設定給藥濃度。

1.3.2.3給藥處理 移除原有培養基，按實驗設定藥物濃度，每孔加入200 μL含藥完全培養基，置培養箱中繼續培養72 h。

1.3.2.4細胞毒性檢測 給藥結束后棄除培養基，加入用PBS配制的MTT溶液(0.5 mg/mL)，每孔100 μL，37 ℃恒溫避光孵育4 h；接著棄去MTT溶液，加入DMSO(每孔150 μL)，置微孔板振蕩器上快速振蕩10 min、混勻，隨后把96孔板置于多功能酶標儀中檢測其吸光度OD值(測定波長為490 nm)。

1.3.2.5檢測得到的OD值，使用軟件GraphPad Prism5 制作生長抑制曲線，并計算藥物半數抑制濃度IC50值。

1.3.3裸鼠異種移植瘤模型的建立

1.3.3.1動物處理及飼養 BALB/c-nude小鼠購回后，先在飼養的SPF級動物實驗中心適應環境1周后，開始移植瘤模型的構建。

1.3.3.2腫瘤細胞的移植 將處于對數生長期，且生長狀態良好的A549/DDP細胞消化后，用無血清的1640培養基混懸，并用臺盼藍染色后計算活細胞數，混懸細胞，按3.0×106/只將混懸好的細胞注射到裸鼠的右前肢腋下。

1.3.3.3接瘤后觀察指標 腫瘤細胞移植后，每天觀察腫瘤細胞在體內的生長的情況，并用游標卡尺測量腫瘤大小[腫瘤體積的計算公式：TV (mm3)=(L×W2)/2]，同時記錄下裸鼠的體質量，并觀察其精神狀態、活動、飲食和大小便情況等。

1.3.4紫草素對A549/DDP裸鼠異種移植瘤的影響

1.3.4.1實驗分組與給藥 待腫瘤體積均達到50～100 mm3時，將裸鼠按照腫瘤體積和體質量分為5組：玉米油空白對照組(control)、環磷酰胺25 mg/kg陽性對照組(CTX)，順鉑2 mg/kg組(DDP)、紫草素2 mg/kg組(SHK)、順鉑2 mg/kg+紫草素2 mg/kg混合組(DDP+SHK)，每組8只。根據前期紫草素在體內抗肺腺癌藥效實驗結果[8]，給藥方案予每天1次，按上述劑量連續23 d腹腔注射相應藥物。

1.3.4.2給藥期間檢測指標 觀察腫瘤細胞在體內的生長情況，并同時使用游標卡尺測量腫瘤大小，記錄下裸鼠的體質量和腫瘤體積大小(3天/次)，并觀察其精神狀態、活動、飲食和大小便的情況。

1.3.4.3評價指標 結束23 d的給藥后，解剖小鼠，分離取出腫瘤組織及心、肝、脾、肺、腎等主要器官，并分別進行稱重、樣品保存。

1.3.5A549對順鉑及紫草素的耐藥指數評價

1.3.5.1細胞準備 A549細胞接種于75 flask，培養過夜，待細胞生長狀態恢復，再進行后續實驗。

1.3.5.2藥物處理 移除原有培養基，分別加入含順鉑 (5 μmol/L) 或紫草素 (2 μmol/L)完整培養基各10 mL，置培養箱中繼續培養。

1.3.5.3耐藥培養 待細胞長至75 flask約80%時，胰酶消化，使用正常完全培養基按1∶3傳代。重復上述步驟，使A549分別反復長期暴露于含順鉑 (5 μmol/L) 或紫草素 (2 μmol/L)的完全培養基，以獲得A549順鉑耐藥株或A549紫草素耐藥株。

1.3.5.4耐藥性評價 分別于長期藥物暴露的第0、5、16、20代，使用MTT法，檢測順鉑(0、2、4、6、8、10、20 μmol/L)和紫草素(0、1、2、4、6、8 μmol/L)對細胞株活力影響。使用軟件Graph Pad Prism5計算藥物半數抑制濃度IC50值。利用耐藥指數評價細胞耐藥性：耐藥指數(RI)= IC50(第X代)/IC50(第0代)。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1紫草素對人肺腺癌A549/DDP耐藥性的逆轉作用

紫草素分別干預A549細胞、A549/DDP耐藥細胞，MTT法檢測A549細胞IC50值為2.27 μmol/L，A549/DDP耐藥細胞株的IC50為0.95 μmol/L，實驗結果表明，A549順鉑耐藥株對紫草素不具有耐受性，相反，紫草素對A549順鉑耐藥細胞具有更高的殺傷效力，見圖1。

圖1 MTT法檢測紫草素對A549細胞、A549/DDP耐藥細胞的細胞活力

2.2 紫草素對A549/DDP裸鼠異種移植瘤的抑制作用

建立A549/DDP順鉑耐藥移植瘤裸鼠模型，按“1.3.4”項下方法分5組考察紫草素 (SHK,2 mg/kg) 對耐順鉑A549細胞的體內生長抑制率。與對照組相比，給藥期間小鼠的體質量無明顯變化，且各組差異不大 (圖2A)。與對照組相比，DDP、SHK、DDP+SHK以及25 mg/kg CTX組均可以抑制腫瘤的生長，腫瘤體積及重量如圖2B、圖2C)，其中，紫草素可有效阻滯A549/DDP耐藥細胞的體內生長 (抑瘤率35.91%，P<0.05)，且與順鉑聯合給藥時，更能顯著增加A549/DDP細胞對順鉑的敏感性(聯合組抑瘤率46.19%vs.順鉑給藥組抑瘤率13.98%，P<0.01)。解剖各組小鼠取常規臟器心、肝、脾、肺、腎，檢測臟器指數，結果顯示各組臟器指數無明顯差異(圖3)。

2.3 紫草素耐藥指數評價

在上述試驗中，筆者發現紫草素對于A549/DDP 的敏感性較單純的A549更高，在體內可抑制耐藥細胞生長，且在體內與順鉑聯合給藥時，更能顯著增加A549/DDP細胞對順鉑的敏感性。但長期使用紫草素是否會產生類順鉑樣耐藥性尚未清楚，本研究以順鉑為陽性對照，采用逐代耐藥篩選實驗，MTT法檢測，結果顯示經順鉑(5 μmol/L)處理的A549敏感期IC50值為9.08 μmol/L，培養至第20代，IC50值為30.38 μmol/L，計算耐藥指數RI為3.35(表1)，且細胞存活率呈逐代上升趨勢(圖4A)，說明A549細胞對順鉑逐漸產生耐藥性。相反，經紫草素(2 μmol/L)干預的A549細胞耐藥指數呈現下降的趨勢(表1)，細胞存活率呈逐代下降趨勢(圖4B)表明紫草素無類順鉑樣耐藥反應。

A：A549/DDP耐藥移植瘤裸鼠在給藥期間體質量(n=8);B：藥物干預后各組腫瘤組織體積比較;C：腫瘤組織照片及其重量;*:P<0.05,**:P< 0.01;***:P<0.001，與對照組比較,△:P<0.05,△△:P<0.01，與順鉑組比較

圖2紫草素對A549/DDP裸鼠異種移植瘤的抑制作用

A：心；B：肝；C：脾；D：肺；E：腎

圖3藥物干預后各組移植瘤裸鼠臟器指數評估

表1 順鉑及紫草素對A549肺腺癌細胞耐藥指數評價

A：順鉑5 μmol/L ；B：紫草素2 μmol/L干預下A549細胞的存活率

圖4 MTT法檢測長期順鉑和紫草素

3 討 論

在威脅人類生命健康的各種惡性腫瘤中，肺癌的發病率和死亡率一直居高不下，其主要的原因在于其易發性、耐藥性和高轉移性[8]。肺癌細胞對化療藥物產生耐藥是影響療效和預后的重要因素[2]，因此，鉑類耐藥是臨床治療肺癌的難題，期望能找到有效的抑制劑，與鉑類藥物聯合使用提高療效。紫草素對多種腫瘤細胞具有殺傷作用且可增加抗腫瘤治療敏感性[9]。關于紫草素對肺腺癌化療逆轉耐藥性的研究鮮有報道，本文通過體內、體外相結合實驗證實，紫草素在不產生細胞毒性條件下能夠逆轉人肺腺癌耐藥細胞A549/DPP 對順鉑的耐藥性，紫草素與順鉑聯合用藥后，增強順鉑對肺腺癌耐藥細胞株的殺傷作用，提高耐藥細胞株對順鉑的敏感性。

綜上所述，紫草素具有逆轉肺腺癌順鉑耐藥作用，而且具有目前臨床藥物所缺乏的高效、安全性較好的優勢，有很大的研究價值。