兩種中藥制劑對IPEC—1細胞因子表達的影響

施杏芬　邵斌　林輝　占永祥

摘要：為研究戈戈健和本草勁方對豬腸上皮細胞因子表達的影響，本實驗分別以200μg/mL的戈戈健和500μg/mL的本草勁方溶液處理豬腸上皮細胞，培養后收集細胞，提取總RNA，反轉錄成cDNA，通過熒光定量PCR測定各種相關細胞因子mRNA表達水平。結果顯示，戈戈健能顯著上調IFN-β（P<0.05）、IL-6（P<0.05）、IL-8（P<0.01）、TNF-α（P<0.05）和TGF-β（P<0.05）mRNA表達水平；本草勁方能顯著上調IFN-α（P<0.05）、IFN-β（P<0.01）和TGF-β（P<0.05）mRNA表達水平，顯著下調IL-6（P<0.05）和TNF-α（P<0.01）mRNA表達水平。表明這兩種中藥制劑均能通過誘導I型干擾素產生而發揮抗病毒作用；戈戈健能通過促進抗炎因子IL-6、IL-8和TNF-α分泌來增強細胞免疫，同時上調抑炎因子TGF-β表達來防止過度炎癥；本草勁方能抑制促炎因子IL-6和TNF-α的產生并促進抑炎因子TGF-β的分泌，從而增強細胞的抗炎能力。本研究為戈戈健和本草勁方用于預防和治療豬場病毒病提供了理論依據。

關鍵詞：黃芪多糖；雙黃連；IPEC-1；細胞因子；抗病毒；抗炎

近年來，傳染性疾病制約著我國養豬業的發展，尤其是病毒病的危害最嚴重…，如豬瘟、流感、偽狂犬病和繁殖與呼吸綜合癥等惡性病毒病給養殖戶造成了極大的經濟損失。目前防治病毒病最常用的方法是注射疫苗，但由于病毒變異快，血清型多，導致疫苗的應用效果不理想。研究發現，許多中藥有良好的抗病毒作用，能增強動物的免疫力，改善機體的不良反應，而且中藥價格低廉、毒副作用小、不會產生耐藥性，能廣泛應用于病毒病的預防和治療。戈戈健的主要成分是黃芪多糖粉，黃芪多糖是中藥黃芪的主要活性成分，大量研究表明，黃芪多糖不僅能直接殺滅病毒，還能通過誘導產生干擾素，增強巨噬細胞功能而達到抗病毒的效果；可作為免疫增強劑，提高多種疫苗的抗體水平，增強疫苗免疫的效果；能提高機體的特異性和非特異性免疫功能，減少動物疾病的發生。本草勁方的主要成分是雙黃連可溶性粉，由金銀花、連翹和黃芩三味中藥研制而成，對多種致病菌和病毒有較強的殺滅或抑制作用，臨床用于治療細菌和病毒感染所引起的肺炎、氣管炎、支氣管炎、扁桃體炎等上呼吸道感染。本研究通過體外培養豬腸上皮細胞（IPEC-1），用戈戈健和本草勁方處理，分析各種相關細胞因子mRNA表達水平的變化情況，探討這兩種中藥制劑抗病毒、抗炎癥和增強免疫力的作用機理，旨在為其應用于豬場病毒病的預防和治療提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

IPEC-1細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院；戈戈?。S芪多糖粉）和本草勁方（雙黃連可溶性粉）由浙江博信藥業有限公司提供，用PBS配制成溶液，濃度分別為4mg/mL和10mg/mL。

1.2主要試劑

含雙抗（1001U/mL青霉素和100ug/mL鏈霉素）的DMEM培養液、D-Hanks液、0.25%胰酶（含0.02%EDTA）、胎牛血清均購自杭州四季青生物工程材料有限公司；RNA提取試劑盒（Trizol）購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3細胞培養及處理

IPEC-1細胞用含有10%胎牛血清的雙抗DMEM培養基，于37℃5%CO，條件下培養，每24h換液，48h傳代。采用臺盼藍法檢測細胞活性，保持在95%以上。以培養液調整細胞濃度至1×10。個/mL，按每孔0.95mL接種至12孔細胞培養板中，37℃5%CO，繼續培養6h，待細胞貼壁，進行試驗。試驗分為空白對照組、處理組1和處理組2，每組3個重復孔。對照組加入50μLPBS；處理組1加入50μL戈戈健溶液，使其終濃度為200μg/mL；處理組2加入50μL本草勁方溶液，使其終濃度為500μg/mL，37℃5%CO₂繼續培養6h。

1.4樣品收集與測定

收集培養后的細胞，提取總RNA，反轉錄成cDNA，通過熒光定量PCR測定干擾素-α（IFN-α）、干擾素-β（IFN-β）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和轉化生長因子-β（TGF-β）的mRNA表達量，以B-actin基因為內參，采用Pfaffl建立的方法計算所有基因的相對表達量。

1.5數據處理

采用SPSS 17.0軟件對數據進行單因素方差分析及Duncans法多重比較。以P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著，結果均以平均值±標準誤表示。

2結果分析

2.1兩種中藥制劑對IFN表達的影響

由圖1可以看出，與對照組相比，處理組1和處理組2的IFN-α mRNA相對表達量均上升，其中處理組2的差異達到顯著水平（P<0.05）。由圖2可以看出，處理組1的IFN-β mRNA相對表達量較對照組顯著上升（P<0.05），處理組2的IFN-β mRNA相對表達量較對照組極顯著上升（P<0.01）。試驗結果表明，戈戈健和本草勁方均能誘導腸上皮細胞產生干擾素。

2.2兩種中藥制劑對促炎細胞因子表達的影響

由圖3可以看出，處理組1的IL-6 mRNA相對表達量較對照組顯著上升（P<0.05），處理組2的IL-6 mRNA相對表達量較對照組顯著減少（P<0.05）。由圖4可以看出，處理組1的IL-8 mRNA相對表達量較對照組極顯著上升（P<0.01），處理組2的IL-8 mRNA相對表達量較對照組減少，但未達到顯著水平。由圖5可以看出，處理組1的TNF-α mRNA相對表達量較對照組顯著上升（P<0.05），處理組2的TNF-α mRNA相對表達量較對照組極顯著減少（P<0.01）。試驗結果表明，戈戈健能誘導促炎細胞因子產生；本草勁方對促炎細胞因子有明顯的抑制作用。

2.3兩種中藥制劑對抑炎細胞因子表達的影響

由圖6可以看出，與對照組相比，處理組1和處理組2的TGF-β mRNA相對表達量均顯著上升（P<0.05）。

試驗結果表明，戈戈健和本草勁方均能誘導抑炎細胞因子產生。

3討論

干擾素是由機體細胞產生的一類多功能活性蛋白，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤活性及免疫調節等多種生物學活性。按照國際標準，干擾素分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三類，IFN-α、IFN-β屬于Ⅰ類干擾素，當病毒作用于機體細胞時，Ⅰ型干擾素在數小時內大量產生，作為機體防御系統中出現最早的細胞因子，在防止病毒在體內擴散的前期起著重要的作用。劉立民等通過體外實驗研究發現黃芪多糖能顯著提高漿細胞樣樹突狀細胞分泌的IFN-α量，促進自身及其它細胞分泌細胞因子來抑制病毒的復制。胡克杰等研究表明精制雙黃連氣霧劑有誘導人外周白細胞產生IFN-α的作用。徐凱建等研究發現雙黃連氣霧劑和注射劑均能促進淋巴細胞產生IFN-α。本研究表明，戈戈健能誘導IPEC-1的IFN-α表達水平上升，并顯著上調IFN-β mRNA表達水平；本草勁方能誘導IFN-α和IFN-β mRNA的表達水平顯著上升，提示這兩種中藥制劑均能通過誘導IPEC-1產生Ⅰ型干擾素來抑制病毒的入侵及復制。

炎癥細胞因子可分為促炎和抑炎細胞因子兩大類，促炎細胞因子包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α和IFN-γ等，抑炎細胞因子包括IL-4、IL-10、IL-13、IL-14和TGF-β等。機體受到病原體感染后出現免疫應答，釋放促炎細胞因子，引起機體炎癥反應，阻止病毒進一步擴散，而抗炎細胞因子能防止過度炎癥反應，從而避免組織器官嚴重損傷。劉立民等通過體外培養漿細胞樣樹突狀細胞，用ELISA法檢測出黃芪多糖能顯著提高IL-6和TNF-α的分泌量，促進B細胞向漿細胞分化，提高免疫球蛋白的分泌量，從而增強機體抗感染的能力。鄒云等通過飼養試驗研究發現，添加黃芪多糖能顯著提高斷奶仔豬血清中的TNF含量，也能在一定程度上提高IL-6的含量。本實驗結果顯示，戈戈健能誘導抗炎因子IL-6、IL-8和TNF-α mRNA表達水平顯著上升，具有一定的免疫增強作用，同時上調抑炎因子TGF-βmRNA表達以防止過度炎癥。

TNF-α是由單核巨噬細胞分泌的一種多肽調節因子，能誘導IL-6、IL-8等一系列炎癥介質的釋放，導致機體產生炎癥反應。賈鷹玨等用雙黃連微乳劑治療胸膜炎模型大鼠，研究發現，雙黃連能顯著降低大鼠胸腔滲出液中的TNF-α含量，對IL-8也有一定的抑制作用，提示雙黃連具有抗炎作用。李安泰等研究發現雙黃連注射液能通過降低血清和腦脊液中的炎癥因子IL-6和TNF-α的表達水平來治療病毒性腦炎。本研究表明，本草勁方能抑制促炎因子IL-6和TNF-α的產生，同時促進抑炎因子TGF-β的分泌，從而增強細胞的抗炎能力。

4小結

綜上所述，戈戈健具有抗病毒、增強機體免疫的作用，本草勁方具有抗病毒、抗炎的作用，兩種中藥制劑均能用于預防和治療豬場病毒病，值得在養殖生產實踐中推廣。