氨茶堿對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠炎性因子及T淋巴細胞亞群的影響

郭偉峰 黃 弘 何約明 莊錫彬

(福建醫科大學附屬泉州第一醫院呼吸內科，福建 泉州 362000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床常見的呼吸道疾病，主要表現為持續及進行性加重的氣流受限及通氣功能障礙。COPD實質是一種慢性氣道炎癥性疾病，炎癥細胞浸潤刺激大量的炎性介質釋放，引起黏液分泌增加，加重炎癥反應和氣道阻塞癥狀〔1，2〕，患者常伴免疫功能異常，尤其是細胞免疫功能紊亂。氨茶堿為茶堿與乙二胺的復鹽，茶堿可增強膈肌收縮力，乙二胺可增強水溶性，廣泛用于COPD急性加重期或穩定期患者的治療中〔3〕。氨茶堿有抑制炎癥反應與調節免疫功能的作用，但具體機制尚不清楚。本文通過動物實驗探討氨茶堿對COPD模型大鼠炎性因子及T細胞亞群的影響，分析氨茶堿對COPD的防治作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠8只，6～8周齡；體質量200～250 g，平均(220.24±20.12)g；購自福建醫科大學動物實驗中心(許可證號：SCXK20151210)；飼養條件：室溫(25.21±1.24)℃，相對濕度50%～60%，常規進食、飲水，適應性飼養1 w后進行試驗。

1.2主要材料 氨茶堿片(上海信誼天平藥物有限公司，批準文號：國藥準字H31021799，規格0.1 g×48片)；辛伐他汀片(國藥集團工業有限公司，批準文號：國藥準字H20103418，規格20 mg×10片)；脂多糖(LPS，美國Sigma公司)；戊巴比妥鈉(上海新亞藥業有限公司，批準文號：國藥準字H31021724，規格100 mg)；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑(北京晶美生物工程有限公司)。

全自動生化分析儀：日本日立7600型；流式細胞儀：貝克曼庫爾特Gallios型；高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠TGL-16型；恒溫冰箱：天津泰斯特儀器有限公司HH-W21-60型；光學相差顯微鏡：日本Olympus公司CKX41型；病理圖像分析系統：Germany公司Leica Qwin standard2.8。

1.3動物分組及模型制作 按照隨機數字表法將32只大鼠分為對照組、模型組、氨茶堿組和辛伐他汀組各8只。COPD大鼠模型的制備采用氣管注射LPS合并熏香煙法〔4〕。除對照組外，其余三組大鼠于第1、14天，用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，將靜脈套管針快速插入大鼠氣管，注入LPS 200 μg/200 μl，隨后將大鼠直立旋轉，使LPS均勻分布于兩肺。第30～56天(第42天除外)，每日將大鼠置于60 cm×50 cm×40 cm的密封箱內，向密封箱中持續注入香煙煙霧30 min，上、下午各注入1次。

1.4藥物干預 除煙熏時間外，所有大鼠在相同環境下飼養。建立大鼠COPD模型后，模型組用生理鹽水1 ml/100 g灌胃，1次/d；氨茶堿組用氨茶堿50 mg/kg灌胃，1次/d；辛伐他汀組用辛伐他汀5 mg/kg灌胃，1次/d。對照組用生理鹽水1 ml/100 g灌胃，1次/d。大鼠均連續灌胃2個月。

1.5肺組織病理學檢查 大鼠心臟采血法致死后，將右肺中下葉置于甲醛溶液中浸泡24 h，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.6炎性因子檢測 大鼠心臟采血法致死后，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)6 ml，1 000 r/min離心15 min取上清液，采用ELISA法檢測BALF中白細胞介素(IL)-8、IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量。

1.7外周血T淋巴細胞亞群檢測 大鼠心臟采血法致死后，采集腹主動脈血4 ml分離血清后，采用流式細胞儀測定各組大鼠外周血T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+，計算CD4+/CD8+值。

1.8統計學分析 采用SPSS21.0軟件行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1肺組織病理學改變 對照組大鼠支氣管肺組織結構完整，纖毛排列整齊，纖毛間夾雜少量杯狀細胞，管壁可見少數散在淋巴細胞。模型組肺組織支氣管上皮細胞部分脫落，可見纖毛粘連或壞死，黏膜下層與肌層出現大量炎性細胞浸潤，支氣管平滑肌、肺泡隔明顯增厚，管腔內出現大量中性粒細胞、巨噬細胞與黏液分泌物，可見炎性細胞浸潤與毛細血管擴張充血。辛伐他汀組、氨茶堿組肺組織病變明顯好轉。見圖1。

2.2各組炎性因子水平比較 模型組BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量均明顯高于對照組(P<0.001)；辛伐他汀組、氨茶堿組BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明顯低于模型組(P<0.05)；氨茶堿組BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明顯低于辛伐他汀組(P<0.05)，見表1。

圖1 各組肺組織病理改變(HE，×100)

組別IL-8(ng/L)IL-17(ng/L)TNF-α(ng/L)T淋巴細胞總數(個)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+對照組338.17±20.5955.82±3.01126.83±8.472 815.34±305.5635.71±2.3910.61±0.563.39±0.20模型組602.86±45.731)90.04±7.121)210.59±11.261)1 742.81±200.782)32.18±2.572)12.49±0.732)2.54±0.262)辛伐他汀組482.79±26.053)79.13±5.463)189.47±6.833)1 938.73±214.653)33.54±2.243)11.73±0.713)2.97±0.283)氨茶堿組457.32±21.743)4)62.35±5.083)4)156.06±8.523)4)2 209.45±220.973)4)34.69±2.383)4)11.02±0.593)4)3.26±0.253)4)F/P值8.695/0.0027.324/0.0089.112/0.0006.345/0.0102.456/0.0285.321/0.0166.132/0.011

與對照組比較：1)P<0.001,2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.05；與辛伐他汀組比較：4)P<0.05

2.3各組外周血T淋巴細胞水平比較 模型組T淋巴細胞總數、CD4+、CD4+/CD8+均明顯低于對照組，CD8+高于對照組(P<0.05)；辛伐他汀組、氨茶堿組T淋巴細胞總數、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯高于模型組，CD8+明顯低于模型組(P<0.05)；氨茶堿組T淋巴細胞總數、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯高于辛伐他汀組，CD8+明顯低于辛伐他汀組(P<0.05)，見表1。

3 討 論

COPD是一種以持續氣流受限為特征的慢性肺部疾病，與反復煙霧等有害顆粒或氣體對肺組織和氣道的慢性刺激及由此引起的異常炎性反應有關，已成為一個重要的公共衛生問題〔5〕。近年研究發現，氨茶堿有促進細胞外鈣離子內流的作用，同時具有抑制炎癥反應與調節免疫的作用，可能與抑制炎性細胞的生成與釋放有關〔6〕。在臨床實踐中，氨茶堿是治療COPD穩定期及急性加重期的常用藥物，診斷、處理和預防全球策略(2013年版)中將茶堿類藥物作為二線治療藥物〔7〕。

COPD是一種慢性氣道炎癥性疾病，炎癥反應與疾病進展密切相關，IL-17參與中性粒細胞活化、遷移、聚集；IL-8激活趨化嗜中性粒細胞與T淋巴細胞，促進炎癥過程；TNF-α是一種具有調節免疫與炎性反應的細胞因子，無論是動物實驗還是臨床研究均表明，COPD大鼠或患者BALF中血清IL-17、IL-8、TNF-α含量均明顯升高〔8，9〕，本研究也證實了該觀點。辛伐他汀可抑制肺部及系統性炎癥反應，減輕肺氣腫程度，延緩肺功能下降〔10〕。氨茶堿的藥理作用主要來自茶堿，茶堿的抗炎作用可能與抑制磷酸二酯酶活性、神經肽的釋放、氧自由基等有關〔11〕。本研究結果提示氨茶堿更能有效地抑制COPD模型大鼠炎性因子表達水平，國內外學者也有類似的文獻報道〔7，12〕。

T淋巴細胞是人體免疫系統的重要組成部分，具有識別和排除抗原、調節機體免疫應答、參與異常炎癥反應的作用。COPD氣道炎癥可分為兩期，初發期侵犯氣管上皮和黏膜下層，引起中性粒細胞趨化反應和巨噬細胞吞噬反應；隨著疾病繼續發展，炎癥向縱深擴展，則T淋巴細胞亞群數量之間的平衡遭到破壞，CD8+細胞增多，通過免疫應答引起肺自身抗原-抗體反應，進而引起肺損傷，導致肺氣腫的發生〔13〕，T淋巴細胞亞群中CD8+細胞增多是COPD的特征性免疫反應。李建生等〔14〕發現，氨茶堿對COPD穩定期大鼠外周血和肺臟局部T淋巴細胞亞群均具有明顯的調節作用，本文研究結果也支持這一觀點。

本研究結果表明，氨茶堿有助于緩解COPD模型大鼠炎癥狀態，改善機體免疫功能。但其作用機制尚未明確，有待于更多的基礎研究與臨床研究去證實。