三七皂苷Rg1對肺纖維化大鼠信號傳導蛋白3和胰島素樣生長因子-1 mRNA 表達的影響

黃 鋒 賈巖龍 邵煥霞 詹合琴 孫 娟 劉會茹 牛 倩

(新鄉醫學院藥學院，河南 新鄉 453003)

肺纖維化(PF)是由多種原因引起的彌漫性肺部疾病的最終結果，該病的主要特征是成纖維細胞的過度增殖與細胞外基質(ECM)異常沉積〔1，2〕。PF臨床癥狀主要是缺氧、進行性的呼吸困難、干咳、酸中毒和呼吸衰竭〔3〕。該病確診后平均可存活為2～5年，一般年齡越大發病率越高，發病原因可能與遺傳、環境污染、藥物(如百草枯)、免疫力異常、二氧化硅等因素相關〔4,5〕。盡管PF的發病機制不明，但目前比較認同的一個基本機制為：各種不良因素刺激引起肺部損傷或炎癥，導致肺泡與肺間質中巨噬細胞等其他炎性細胞浸潤，導致炎性細胞分泌的細胞因子表達增多，進而促使成纖維細胞分裂、增殖為肌成纖維細胞，致使ECM異常沉積，最終形成PF〔6,7〕。胰島素樣生長因子(IGF)-1作為一個旁分泌成纖維細胞的激活劑在成纖維細胞的激活和PF發生中起著重要的作用〔8，9〕。信號傳導蛋白(Smad)3也是PF的重要介導者，其在PF的發生和上皮間質轉化過程中起重要調節作用〔10，11〕。三七皂苷Rg1是從云南中藥材三七根莖中提取的單體化合物，為三七總皂苷的主要成分之一〔12〕。三七總皂苷在動物模型中具有顯著的抗PF作用〔13〕，但其單體成分三七皂苷Rg1對PF保護作用及其對PF組織中Smad3和IGF-1基因表達的影響尚不清楚。本研究探討博來霉素誘導的PF大鼠采用三七皂苷Rg1治療后Smad3和 IGF-1 mRNA 表達的變化。

1 材料與方法

1.1藥物、試劑和儀器 三七皂苷Rg1由四川成都瑞芬思生物科技有限公司提供，為白色粉末，純度>98%；博來霉素由日本化藥株式會社提供(15 mg/支，產品批號：460430)；羥脯氨酸(Hyp)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；All-in-OneTMFirst strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒、HiScript TM QRT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 購自南京Vazyme 科技公司；Smad3 (GeneCopoeia?,USA,ID:MQP030343)，IGF-1 (GeneCopoeia?,USA,ID:MQP026708)和內參GAPDH(GeneCopoeia?,USA,ID:MQP027158)購于鄭州樂睿生物科技有限公司；瓊脂糖(批號111760)購于西班牙Biowest公司。其他常規試劑如異丙醇、氯仿和焦碳酸二乙酯(DEPC)等購于上海化學試劑公司。ABI StepOne實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀，美國ABI公司；Nanodrop-2000紫外/可見光分光光度計，美國賽默飛世爾公司；AE240精密分析天平瑞士Mettler公司;MulTISKAN酶標儀,美國Thermo公司；16K-R低溫臺式離心機，長沙鑫奧儀器儀表有限公司；Hfsafe-1200 生物安全柜，西化儀北京科技有限公司；MDF-U4086S超低溫冰箱，日本SANYO公司；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2PF模型的制備 清潔級SD成年雄性大鼠，購于鄭州大學動物實驗中心(許可證號：SCXK Henan 2010-0001，合格證號：No.0005496)。本項目對動物的處理遵照新鄉醫學院動物管理委員會和中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。用單一劑量5 mg/kg的博來霉素氣管內注射誘導PF模型〔14,15〕。大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)使其麻醉，然后仰臥固定于大鼠解剖臺上。大鼠頸部正中皮膚切口2～3 cm,將博來霉素快速注入氣管，然后使動物直立并旋轉幾次，以保證藥物能均勻地分散到肺組織。手術區域再次消毒后分層縫合，動物被放回籠中密切觀察。假手術組經歷同樣的手術過程，但氣管內滴入生理鹽水代替博來霉素。

1.3動物分組和給藥 138只清潔級健康雄性SD大鼠，體重(240±10)g，隨機分為假手術組、模型組、模型+陽性對照(M+P)組、模型+三七皂苷Rg1低劑量(18 mg/kg)(M+RL)組、模型+中劑量(36 mg/kg)(M+RM)組和模型+高劑量(72 mg/kg)(M+RH)組，共6組，假手術組動物18只，其他各組每組24只。假手術組無死亡，其他各組剔除死亡動物后，模型組14只，陽性對照組、M+RL和M+RM組各18只，M+RH組20只。此實驗在動物造模后當天開始給藥，每天1次，均采用灌胃給藥。假手術組和模型組給予同等體積的生理鹽水(5 ml/kg)，M+P組給予醋酸潑尼松(5 mg/kg)，三七皂苷Rg1各劑量組給予相應劑量的三七皂苷Rg1。至連續用藥7 d時，處死每一組中的一半動物，剩余的各組動物接著用藥至28 d后再處死。每一組中6只動物的肺組織用于qPCR測定，其余動物的肺組織用于測定PF評分和Hyp的含量。

1.4Masson染色和PF評分 大鼠右中肺葉制成5 μm厚石蠟切片。組織切片用Masson三色藍染色方法進行染色。石蠟切片常規脫蠟后用蘇木素染色6 min，Masson復合染色液5 min，5%磷鎢酸5 min和2%苯胺藍液5 min，染色完畢后用高清晰圖像分析儀攝像觀察。照片中藍色越多表明PF程度越重，根據肺組織Masson染色情況并參照PF評分標準，進行評分。PF分級：0級：無PF(-)；1級：輕度PF(+)，病變范圍局限在全肺20%以下；2級：中度PF()，病變范圍占全肺20%～50%；3級：重度PF()，病變范圍大于50%，肺泡融合，肺實質結構紊亂。-為0分，+為1分，為2分，為3分，將等級資料轉化為計量資料。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測肺組織中Hyp的含量 各組均取右下葉肺組織0.2 g加1.8 ml的冰鹽水,離心10 min (-4℃，1 000 r/min),取上清液保存在4℃，考馬斯亮藍對各樣品進行蛋白定量。根據標準蛋白的濃度和吸光度值求出Hyp的回歸方程和相關系數為Y=0.002 2X-0.106 8，R2=0.949。每個樣本Hyp的有色試樣吸光度值(OD值)用MulTISKAN酶標儀(Mk3,Thermo,USA)在450 nm波長處測定，然后將樣品的OD值代入方程式計算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數，即可得出每一樣品所含的Hyp含量，每個樣品的OD值越大，其蛋白含量越高。

1.6qPCR技術檢測Smad3和IGF-1 mRNA的表達 處死大鼠后，取100 mg的左肺組織在液氮中磨碎。Trizol試劑提取樣本中的總RNA，用HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 試劑盒反轉錄成cDNA。取各樣本中1 μl的cDNA用AceQTM qPCR SYBR? Green Master Mix試劑盒執行qRT-PCR過程。PCR反應采用連續檢測系統執行。熱循環和SYBR綠色熒光被用于qRT-PCR的定量檢測。PCR條件為：95℃ 10 min;95℃ 10 s,60℃ 20 s,72℃ 15 s,40個循環。溶解曲線分析被用于執行終止PCR循環后對非特異性PCR產物和引物二聚體的評估。在初始優化運行期間,4倍系列的稀釋用于顯示每個基因的線性放大范圍。閾值循環(Ct)代表PCR循環中一個綠色SYBR熒光的增加高于基線信號可以被首先檢測到。根據每組每個樣本的Ct值相對定量得出ΔCt，ΔCt對應于目的基因Ct和參考基因Ct之間的差異。最后按F=2-ΔΔCt 計算方法取每組的2-ΔΔCt值檢測目的基因與對照基因表達的差異。

1.7統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析，方差齊者采用 LSD 方法，方差不齊者采用DunnettT3方法，組內時間點的比較采取t檢驗。

2 結 果

2.1三七皂苷Rg1對PF大鼠PF評分的影響 模型組PF評分(3.29分)較高，與假手術組(0.28分)差異有統計學意義(P<0.01)；三七皂苷Rg1各劑量組均可降低PF評分(M+RL組1.57分、M+RM組1.43分、M+RH組1.15分)，與模型組差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，其低、中、高劑量之間存在劑量依賴性；與M+P組(2.00分)比較，M+RH組作用較好(P<0.05)。見圖1。

2.2三七皂苷Rg1對PF大鼠肺組織Hyp含量的影響 給藥28 d后，模型組Hyp含量(2.29±0.32)與假手術組(1.61±0.08)比較顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，M+RL、M+RM、M+RH組呈劑量依賴性地降低Hyp的含量(1.89±0.05、1.66±0.08、1.04±0.18，P<0.05、P<0.01)。M+RM、M+RH組Hyp含量與M+P組(1.92±0.32)相比明顯降低(P<0.05)。

圖1 各組PF評分比較(Masson染色，×200)

2.3三七皂苷Rg1對PF大鼠Smad3 mRNA表達的影響 給藥7 d和28 d后，模型組肺組織Smad3 mRNA表達較假手術組明顯增加(P<0.01)；M+P組、M+RL、M+RM、M+RH組可明顯降低Smad3 mRNA表達，與模型組差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；M+RL、M+RM、M+RH組與M+P組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.4三七皂苷Rg1對PF大鼠IGF-1 mRNA表達的影響 給藥7 d和28 d后模型組肺組織IGF-1 mRNA表達顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，M+RL、M+RM、M+RH、M+P組不同時間點呈劑量依賴性地降低IGF-1 mRNA表達(P<0.05 或P<0.01)；與M+P組比較，M+RH組作用較好(P<0.05)，見表1。

表1 各組給藥7、28 d后肺組織Smad3、IGF-1 mRNA表達

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01;與M+P組比較：4)P<0.05

3 討 論

PF為近年來呼吸系統最嚴重的疾病之一，起病隱匿且病死率高。目前該病發病機制尚不明確，治療方法有限。因此，在建立穩定合理的PF模型的基礎上研究具有保護作用的藥物及其作用機制十分必要。 國內外文獻報告中關于制作PF模型的方法有很多種，如用博來霉素、百草枯、放射線及高濃度氧等，其中博來霉素氣管內給藥因存在方法可靠、操作簡單、周期短等〔16〕優點，且博來霉素誘導的動物PF模型與人PF的病理學改變極其相似，所以用博來霉素誘導PF模型是目前公認的經典造模方法〔17〕。

目前認為PF的特點是經早期的肺損傷-肺泡炎到PF這樣的一個過程〔15，18〕。本實驗結果提示博來霉素誘導PF的典型特征與他人的研究一致〔19〕。Hyp是膠原形成的特征性生物標記之一，在ECM沉積和重構中起重要作用〔20〕。三七皂苷Rg1對PF的病程有減輕和保護作用。

IPF的發生機制通常被認為與轉化生長因子(TGF)-β/Smads信號通路的過度激活有關。有研究發現，如果抑制TGF-β依賴性Smads蛋白家族信號轉導通路中Smad3的表達，可以預防PF的形成〔21，22〕。IGF-1是TGF-β介導的眾多信號傳導途徑中對于纖維化過程起重要作用的輔助因子。以往研究發現，IGF-1在特發性肺間質纖維化病人肺泡灌洗液的水平較正常人高〔23〕，在博來霉素誘導的PF動物模型的肺泡灌洗液細胞中IGF-1 mRNA表達水平較對照組增強〔24〕。本研究結果提示三七皂苷Rg1對PF的保護作用與其降低Smad3 和IGF-1 mRNA的表達有關。