β-淀粉樣蛋白在老齡大鼠術(shù)后認知功能障礙中的作用及石杉堿甲的干預作用

鄧福謀 羅曉東 郎海麗 姚 鵬 方四通 陳 勇 余樹春 徐國海

(南昌大學第二附屬醫(yī)院麻醉科 江西省麻醉學重點實驗室，江西 南昌 330006)

術(shù)后認知功能障礙(POCD)是指患者在手術(shù)后出現(xiàn)認知功能(包括學習、記憶、情緒、情感及判斷力等)整體下降或衰退〔1,2〕，目前其發(fā)病機制尚不完全清楚，也尚未發(fā)現(xiàn)有效改善POCD的藥物及方法。β-淀粉樣蛋白(Aβ)是一種功能未完全明確的跨膜蛋白，已被證實與阿爾茨海默病(AD)早期老年斑形成關(guān)系密切,與神經(jīng)功能損傷有密切關(guān)系，也被稱為是AD的始動因子〔3〕。石杉堿甲(HupA)是一種天然新型石松類生物堿有效單體，同時也是一種高效可逆性的膽堿酯酶抑制劑，具有改善學習及記憶功能的作用〔4,5〕，但其是否可減輕老齡大鼠術(shù)后認知功能及Aβ是否參與其減輕POCD的過程尚不清楚，本研究擬評價HupA對老齡大鼠POCD的影響及Aβ在其中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組及處理 健康老年雄性SD大鼠(南昌大學實驗動物科學部提供)72只，20～22月齡，體重550～700 g，采用隨機數(shù)字表法分為對照組(C組)、POCD組(P組)和Hup A組(H組)，每組24只。H組和C組在手術(shù)前給予Hup A(河南竹林眾生制藥公司，批號：20150101)0.15 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)3 w，P組按體重給予等容量生理鹽水；3 w后P組和H組行脾切除術(shù)，C組不行手術(shù)。

1.2模型制備 參照文獻〔6〕介紹的方法采用脾切除術(shù)建立老齡大鼠術(shù)后認知功能障礙模型。術(shù)前禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg，待麻醉成功后仰臥位固定，腹部皮膚備皮，消毒鋪巾，正中切口開腹，游離脾臟，結(jié)扎脾動靜脈，將脾臟切除后止血關(guān)腹，用無菌敷料貼覆蓋，膠布固定，待大鼠蘇醒后單獨飼養(yǎng)。術(shù)中嚴格無菌操作，術(shù)畢腹腔內(nèi)給予5%頭孢哌酮注射液50 mg/kg預防傷口感染。

1.3大鼠認知功能的測定 采用Morris水迷宮進行測試。所有大鼠于術(shù)前5 d進行適應性學習，每天在水迷宮中自由游泳5 min以適應環(huán)境，分別于手術(shù)后第1、3天和7天(T1～T3)時進行觀察，分別從四個象限的池壁中點將大鼠面向池壁放入池中，記錄其在120 s內(nèi)尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。術(shù)后第8天，將原平臺撤除，記錄其在120 s內(nèi)穿越原先平臺所在位置的次數(shù)，即為穿越平臺次數(shù)。

1.4血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-10濃度的測定 分別于T1～T3時每組隨機取8只大鼠，采集血樣，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清TNF-α、IL-6和IL-10濃度。實驗步驟按照試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明書操作。

1.5海馬Aβ表達的測定 分別于T1～T3時每組隨機取8只大鼠的海馬組織，勻漿，加入蛋白裂解液，提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，1∶5加入6×上樣緩沖液，100℃水浴鍋煮沸10 min，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，敷一抗4℃孵育過夜，次日TBST漂洗10 min×3次，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(稀釋度1∶5 000)室溫孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，采用GelPro4.5 圖像分析軟件，以光密度值與內(nèi)參β-actin光密度值的比值反映目的蛋白表達水平。

1.6統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0軟件，計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1三組術(shù)后各時點逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較 與C組比較，P組T1～T3時點逃避潛伏期延長，H組T1時逃避潛伏期延長，P組和H組穿越平臺次數(shù)均減少(P<0.05)；與P組比較，H組T1～T3時點逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加(P<0.05)，見表1。

表1 三組術(shù)后各時點逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較

與C組比較：1)P<0.05；與P組比較：2)P<0.05；下表同

2.2三組血清TNF-α、IL-6、IL-10及海馬Aβ表達比較 與C組比較，P組和H組血清TNF-α、IL-6及IL-10濃度均升高(P<0.05)；與P組比較，H組血清TNF-α及IL-6濃度降低，IL-10濃度升高(P<0.05)，見表2。與C組比較，P組和H組海馬Aβ表達上調(diào)(P<0.05)；與P組比較，H組海馬Aβ表達下調(diào)(P<0.05)，見表3、圖1。

表2 三組術(shù)后各時點血清TNF-α、IL-6及IL-10濃度比較

表3 三組術(shù)后各時點海馬Aβ表達比較

圖1 三組海馬Aβ表達比較

3 討 論

雖然POCD的發(fā)病原因尚未完全清楚，但年齡是目前唯一已確定的因素，伴隨著年齡的增加，POCD的發(fā)生率也顯著升高，尤其是年齡超過70歲的老年患者〔7〕。同樣在動物實驗中也已經(jīng)證實，老齡大鼠術(shù)后空間記憶力較年輕大鼠明顯降低〔8〕。因此，本研究選取老齡大鼠作為研究對象。

Morris水迷宮實驗是評價嚙齒類動物空間學習記憶功能最經(jīng)典的方法〔9〕。本研究顯示，手術(shù)操作可導致老齡大鼠術(shù)后出現(xiàn)認知功能障礙，表明老齡大鼠POCD模型制備成功。本研究結(jié)果顯是示術(shù)前給予HupA可減輕老齡大鼠術(shù)后認知功能障礙。

TNF-α和IL-6是機體炎性反應中重要的促炎性細胞因子，IL-10則是公認的炎癥及免疫抑制因子。本研究結(jié)果表明，手術(shù)應激可引起老齡大鼠圍術(shù)期炎性細胞因子釋放增多并誘發(fā)炎性反應，而術(shù)前給予HupA可降低圍術(shù)期炎性細胞因子的釋放，從而在一定程度上減輕炎性反應，其機制可能是HupA通過增強膽堿能抗炎通路減輕炎性反應。

Aβ是AD患者老年斑中的主要組成成分，同時也是神經(jīng)損傷和炎癥反應潛在的標記物，可誘發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)及突觸功能障礙，導致乙酰膽堿合成減少；同時也可促進炎性細胞因子表達，誘導神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生，從而導致學習和記憶功能障礙〔11〕。本研究結(jié)果提示HupA可減輕老齡大鼠術(shù)后認知功能障礙，其機制可能與其下調(diào)海馬組織Aβ表達有關(guān)。HupA是一種高選擇性的可逆性膽堿酯酶抑制劑，易通過血腦屏障，發(fā)揮擬膽堿作用，抑制乙酰膽堿水解，從而增加神經(jīng)突觸間隙的乙酰膽堿含量〔12〕；HupA還能減少谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡，保護神經(jīng)元對抗Aβ產(chǎn)生的氧化應激反應及神經(jīng)細胞凋亡作用〔13〕；還具有抑制一氧化氮(NO)的神經(jīng)毒性及對記憶損害的修復作用〔4〕；此外，HupA還可對膽堿能受體發(fā)揮直接作用，刺激毒蕈堿乙酰膽堿受體，并激活蛋白激酶C(PKC)，增加α-分泌酶活性，從而減少Aβ的產(chǎn)生〔14〕。

綜上所述，HupA可減輕老齡大鼠術(shù)后認知功能障礙，機制可能與其降低炎性反應及下調(diào)海馬組織Aβ表達有關(guān)。