Apelin-B對血管性癡呆大鼠學習記憶功能的影響

齊汝霞 張 鵬 楊欣欣 王鳳琴 程葆華

(濟寧醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，山東 濟寧 272067)

Aplein-13主要分布于心臟、大腦、下丘腦中〔1〕，研究表明其是正常人體血漿中最主要的Apelin亞型，血漿濃度為7.7～23.3 μg/L。并且其具有多種不同的生物功能和作用，參與心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等生理病理過程調(diào)節(jié)〔2〕。血管性癡呆(VD)是僅次于阿爾茨海默病(AD)后的第二大癡呆性疾病，也是迄今為止唯一可以治療的癡呆類型〔3〕。本實驗觀察Apelin-13對VD大鼠學習記憶功能的影響并進一步探討其機制。

1 資料與方法

1.1儀器 電子天平(上海電子天平技術有限公司)；烤箱(型號YHG-30×35 ，深圳倍耐爾特科技有限公司)；跳臺儀(上海醫(yī)聯(lián)醫(yī)學儀器發(fā)展有限公司)；電子秤(上海先悅機電有限公司)。

1.2試劑 亞硝基鐵氰化鈉(天津光復精細化工研究所 注冊號：CNAB035-Q)；普魯卡因(上海羽朵生物 產(chǎn)品編號：ML5227)；Apelin-13(Sigma 貨品編號：A6469)；尼氏染色液(北京雷根生物技術有限公司 貨品編號：DK0022-3*100)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色液(美國索來寶公司 貨品編號：T8170)；磷酸二氫鈉(天津市大茂化學試劑廠 級別:分析純 CAS編號:13472-35-0)；多聚甲醛(天津博迪化工股份有限公司 級別:分析純 產(chǎn)品標準號:津Q/HG3076-99)；磷酸氫二鈉(天津市鼎盛鑫化工有限公司 CAS編號:10039-32-4 級別:分析純)；生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準字號：H37022336)；水合氯醛(中國白鶴化工廠，批號：850208)。

1.3VD大鼠模型制備 選用清潔級健康雄性Wistar大鼠，體重180～250 g，由濟寧醫(yī)學院動物飼養(yǎng)中心提供。大鼠在手術前24 h禁食，不禁水，10%水合氯醛3.5 ml/kg給大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后將其固定在大鼠手術臺上，頸部消毒后行正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，腹腔注射降壓藥亞硝基鐵氰化鈉1.25 mg/kg降低腦血流量 ，用動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈15 min，再通10 min，共2次，完成后縫合傷口、保溫飼養(yǎng)。假手術組只分離頸總動脈不夾閉〔4〕。按Longa等〔5〕的五級評分法，符合以下5個條件之一均可鑒定模型成功：大鼠一側(cè)前肢不能充分伸展；向一側(cè)做環(huán)形運動；向一側(cè)傾倒；局部神經(jīng)灶中度喪失；不能自然行走。

1.4動物分組及給藥 造模成功后將其隨機分為模型組、Apelin-13 50 μg/kg組、Apelin-13 100 μg/kg組，假手術組只分離頸總動脈不夾閉。給藥組側(cè)腦室注射Apelin-13 5 μl，模型組和假手術組分別注射等量蒸餾水。側(cè)腦室注射方法：將麻醉大鼠固定在側(cè)腦室定位儀上，剪開大鼠的頭皮，找到頭骨的前囟并以前囟為原點，右移1.6 mm，前移0.8 mm，用筆在此處標記，用大針頭鉆孔，把微量注射器針尖調(diào)至剛剛接觸頭骨處，然后針頭向下進2.8 mm，給予5 μl藥物，3 min內(nèi)注射完，針頭在顱內(nèi)停留1 min，然后縫合。

1.5TTC染色觀察對腦組織缺血的影響 將大鼠用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后直接取腦，在-18℃冰箱中冷凍20 min左右后，將鼠腦置入專用的腦槽，將大腦切為厚度2 mm的連續(xù)切片6片，依次放入十二孔板中，然后注入2%的TTC染色液，避光，放入37℃恒溫箱25 min，均勻染色后，用無菌注射器抽出染色液，再用4%多聚甲醛固定24 h，正常大腦組織染成鮮紅色，缺血組織呈蒼白色，將染色完成的大腦組織依據(jù)切片先后依次排列，用數(shù)碼相機拍照〔6〕。

1.6跳臺實驗觀察大鼠學習記憶能力 術后1 w進行跳臺實驗，跳臺實驗分為訓練期和實驗期。訓練時把大鼠放到跳臺內(nèi)讓其熟悉環(huán)境3 min，然后接通電源5 min，大鼠感受到電擊后，其一般的反應是跳上平臺來逃脫電擊。訓練時如果有大鼠始終沒有跳上平臺則棄去不用。訓練結(jié)束后第2天，再一次將大鼠放入跳臺內(nèi)進行實驗，首先讓大鼠適應3 min，再通電5 min，記錄大鼠第一次跳上平臺的時間，即跳臺潛伏期(SDL)，觀察大鼠在5 min內(nèi)跳下平臺的次數(shù)，即錯誤次數(shù)(ET),若觀察期內(nèi)大鼠未跳下平臺，ET計為0，SDL計為觀察時間為5 min〔5〕。

1.7利用尼氏染色觀察對大鼠神經(jīng)元的影響 術后1 w，大鼠麻醉后，將其仰臥位固定于鼠板上，剪開胸腔，將針頭從心尖刺入左心室用4%多聚甲醛200～250 ml進行灌注(總灌注時間控制在30 min內(nèi))，至大鼠身體僵直，肝臟變硬，將頭部取下迅速取腦，持刀片將大鼠的大腦與小腦分開，留大腦部位平分為三份，取中間一份，置于裝有多聚甲醛液體中固定。24 h后將固定好的大腦切片拿出進行修整、水浸-脫水、透明-浸蠟與包埋-切片、裱片、烤片-脫蠟、復水-染色-脫水、透明-封固。將切片置于100倍顯微鏡下，觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神細胞尼氏小體染色情況〔7〕。

1.8統(tǒng)計方法 采用SPSS18.0軟件進行方差分析及SLD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1TTC染色對腦組織缺血的影響 假手術組大鼠腦切片呈鮮紅色，模型組大鼠觀察到大面積蒼白色梗死灶。與模型組比較，Apelin-13 50 μg/kg組的缺血區(qū)縮小，Apelin-13 100 μg/kg組的缺血區(qū)基本消失。見圖1。

圖1 TTC染色后各組大鼠腦切片缺血區(qū)比較

2.2利用跳臺實驗觀察各組大鼠學習記憶能力

2.2.1對大鼠跳臺實驗SDL的影響 與假手術組〔(287.7±108.8)s〕比較，模型組大鼠跳臺實驗SDL〔(48.6±4.7)s〕顯著縮短(P<0.01)。與模型組相比，Apelin-13 50 μg/kg組〔(184.0±125.67)s〕和Apelin-13 100 μg/kg組〔(192.7±146.1)s〕的SDL顯著延長(P<0.05，P<0.01)。

2.2.2對跳臺實驗ET的影響 與假手術組〔(0.4±1.1)次〕比較，模型組大鼠跳臺實驗的ET〔(3.6±2.4)次〕顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，Apelin-13 100 μg/kg組〔(0.8±0.7)次〕大鼠跳臺實驗ET明顯減少(P<0.05)。Apelin-13 50μg/kg組大鼠跳臺實驗ET〔(2.2±1.8)次〕無明顯變化(P>0.05)

2.3利用尼氏染色觀察對大鼠神經(jīng)元的影響 假手術組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細胞核多為圓形或橢圓形且呈淡紫色，核仁清晰可見，細胞質(zhì)中的尼氏顆粒豐富。模型組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量明顯減少，細胞多呈空泡狀，神經(jīng)元核仁固縮或消失，尼氏顆粒不明顯。

與模型組相比，Apelin-13 50 μg/kg組CA1、CA3區(qū) 神經(jīng)細胞數(shù)量增多，形態(tài)趨于完整，核仁分明;Apelin-13 100 μg/kg組神經(jīng)元數(shù)明顯增多，細胞排列緊密，形態(tài)正常，尼氏體多且清晰。見圖2、圖3。

圖2 各組VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)比較(×40)

圖3 各組VD大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)比較(×40)

3 討 論

本實驗采用夾閉雙側(cè)頸總動脈缺血再灌注并配以注射亞硝基鐵氰化鈉的方法，制備VD模型，造成大鼠進行性的學習記憶損傷和認知功能障礙，能夠較好的模擬人的VD狀態(tài),用于藥理學研究。TTC和大鼠腦組織里的琥珀酸脫氫酶產(chǎn)生反應，生成紅色的不溶物質(zhì)，然而在缺血的大腦組織中脫氫酶的反應性降低，不能發(fā)生染色反應的而表現(xiàn)為白色，所以可以區(qū)分正常的腦組織和缺血的腦組織〔8,9〕。海馬可被分為CA1、CA2、CA3、CA4四個區(qū)〔10〕。目前研究表明，這4個區(qū)域都和學習記憶尤其空間認知功能有關。尼氏體是神經(jīng)細胞中的嗜堿性的細粒或者小體，是一種含鐵質(zhì)的核酸蛋白，在正常情況下都有其固定的形態(tài)，標志著神經(jīng)細胞的存在，可以被堿性染料如焦油紫染成紫藍色。當其受到損傷時，尼氏體變得模糊不清甚至消失，所以尼氏體能表現(xiàn)神經(jīng)元的功能狀態(tài)。本實驗表明Apelin-13在一定程度上可以減少神經(jīng)細胞的損傷，對神經(jīng)元具有保護和修復作用。根據(jù)跳臺實驗推測 Apelin-13能提高VD大鼠的學習記憶能力。綜上，Apelin-13側(cè)腦室注射后，VD大鼠學習記憶功能得以改善，其機制可能與緩解腦組織缺血、減少海馬區(qū)神經(jīng)細胞損傷有關，其具體機制有待進一步研究。