血漿miR-1266在心房顫動患者射頻消融術前后表達變化及其臨床意義

李 冰 劉牟林 王曉燕 李士軍

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧 大連 116011)

心房顫動(房顫)是臨床上最常見的心律失常之一，隨著年齡增長房顫的發(fā)病率不斷增加,可以引起一系列臨床癥狀和嚴重并發(fā)癥，如心衰、血栓栓塞事件，甚至致殘、死亡等嚴重不良后果〔1〕。近年來，射頻消融術治療房顫已經(jīng)得到廣泛應用，但是術后復發(fā)仍是目前房顫治療的最大困擾，始終沒有徹底有效的方法根治房顫〔2〕。只有通過對其發(fā)病機制的深入研究，才可以得出更有效和更安全的治療途徑。目前已證實多種與房顫相關的microRNAs參與了房顫發(fā)生機制的調控。microRNAs是一類非編碼的單鏈小RNA分子，能調控基因表達。有關研究表明循環(huán)microRNAs的水平變化與一些心臟疾病如：心力衰竭、心肌梗死、冠心病及心肌炎等關系密切〔3〕。但目前關于循環(huán)microRNAs在房顫中的相關調節(jié)作用的研究較少，探討循環(huán)microRNAs在房顫發(fā)生發(fā)展中的變化及臨床意義，將推動房顫發(fā)病機制的深入研究，為房顫診斷和治療帶來新的研究方向。本文觀察血漿miR-1266在房顫患者射頻消融術前后表達變化及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1研究對象 挑選60例2015年3月至2016年1月在大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院入院并行射頻消融術的房顫患者，將其作為房顫組，其中陣發(fā)性、持續(xù)性和永久性房顫患者分別為26例、19例和15例，平均年齡為(64.55±6.34)歲，男34例，女26例。同期選擇在大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院體檢中心的健康體檢者20例作為對照組，平均年齡(63.78±5.35)歲，男11例，女9例。房顫組每例患者均有常規(guī)心電圖或24 h動態(tài)心電圖支持診斷。房顫組排除標準：年齡>80歲，甲狀腺功能亢進,糖尿病,血壓控制不良者,左心室功能減低〔左室射血分數(shù)(LVEF)<40%〕，嚴重冠狀動脈疾病,肝、腎功能障礙，急慢性感染性疾病，心肌結構性病變，伴有惡性腫瘤。服用β受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素受體抑制劑或是他汀類的患者不影響入選。對照組年齡、性別與房顫組無明顯差異，無明顯循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)疾病。本研究涉及的被測試者都已告知了研究目的，并簽署了知情同意書。

1.2標本彩集 房顫患者行射頻消融術前抽取外周靜脈血3 ml，對照組同期體檢抽取外周靜脈血3 ml，分別置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，4 h內分離血漿，1 500 r/min離心15 min，吸取上清液放于經(jīng)高壓過的EP管中，并儲存在-80℃冰箱備用。房顫患者射頻消融術后1個月按術前同樣標準采血保存，術后復轉為竇性心律，期間無復發(fā)。

1.3主要試劑及儀器 miRNA酶血清血漿試劑盒(德國凱杰公司)，miR-1266引物和U6引物(Genepharma公司)，Rotor-Gene Q熒光定量PCR擴增儀(德國凱杰公司)，NanoDrop 2000微量核酸測定儀( 賽默飛世爾科技)。

1.4實驗方法 (1)提取RNA；(2)RNA反轉錄：反應條件：①25℃，30 min；②42℃，30 min；③85℃，5 min；④ 4℃保存。(3)實時熒光定量PCR。反應條件如下：預變性：95℃ 3 min；PCR反應，95℃，40個循環(huán)，12 s，62℃ 40 s，采集熒光信號。miR-1266的相對表達量用2-ΔCt表示，ΔCt=(目的microRNAsCt值-U6 Ct值)。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t、χ2檢驗及方差分析。

2 結 果

2.1房顫組和對照組臨床資料和實驗室檢測指標比較 房顫組和對照組在性別、年齡、吸煙史、LVEF、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)方面差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，而在高血壓患者比例、左心房內徑(LAD)、收縮壓、舒張壓、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、肌酐(Cr)、B型腦鈉肽(BNP)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、D-二聚體水平方面兩組差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。在房顫亞組分析中，性別、吸煙史、高血壓患者比例、收縮壓、舒張壓、TC、TG、HDL-C、Cr方面組間差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，而年齡、LAD、LVEF、LDL-C、BNP、hs-CRP、D-二聚體水平方面組間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

2.2血漿miR-1266在房顫患者射頻消融術前后表達變化差異 血漿miR-1266在房顫組射頻消融術前后相對表達量分別為1.92±0.34和0.16±0.06，與對照組(相對表達量為1)比較，術前表達明顯上升而術后表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.000 1)。

表1 房顫組和對照組臨床資料及實驗室檢測指標比較

表2 房顫亞組臨床資料及實驗室檢測指標比較

2.3血漿miR-1266在不同房顫類型患者射頻消融前術后表達差異 血漿miR-1266在陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫和永久性房顫中相對表達量分別為1.65±0.25、1.91±0.37和2.42±0.96，同對照組(相對表達量為1)相比均明顯上升且不同類型房顫組之間比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；而術后各組相對表達量分別為0.17±0.07、0.21±0.05和0.09±0.03，同術前相比均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.000 1)。

3 討 論

在房顫亞組分析中，性別、吸煙史、高血壓患者比例、TC、TG、HDL-C、Cr方面組間差異沒有統(tǒng)計學意義，而左心房內徑、左室射血分數(shù)、LDL-C、Cr、BNP、hs-CRP、D-二聚體水平方面組間差異有統(tǒng)計學意義。房顫患者心房肌細胞容易發(fā)生結構上的改變，可導致高血壓、左房增大等；如果房顫持續(xù)發(fā)生，則心房肌細胞將產(chǎn)生不可逆的結構破壞，導致左室功能下降，如LVEF下降、實驗室檢測指標方面表現(xiàn)BNP增高等；同時發(fā)生并發(fā)癥可能性加大，尤其是血栓形成，D-二聚體有升高的趨勢〔4〕。

本研究顯示血漿miR-1266在房顫患者射頻消融術前后的表達都存在變化，術前表達上調，術后同術前比較表達則明顯下降。研究顯示與房顫有密切聯(lián)系的靶基因有電壓門控鈉通道α亞基(SCN5A)、電壓門控鉀通道E家族β1亞基(KCNE1)、電壓門控鉀通道eag相關H家族2型(KCNH2)〔5〕，它們均是編碼離子通道的相關基因。心房電重構是房顫發(fā)生的重要病理生理改變之一，主要是通過縮短心房肌細胞的動作電位時程，從而使心肌細胞的有效不應期縮短，導致折返的發(fā)生。SCN5A是編碼Na通道α亞基的基因〔6〕，其功能缺失性突變可導致Na電流下降，房內傳導受到阻礙而變緩。功能獲得性突變同樣增加房顫發(fā)生的易感性，主要因為引起QT間期延長綜合征而導致房顫。造成以上表現(xiàn)的可能機制如下：①由于Na電流不斷增加，整個復極過程逐漸緩慢，此時L型鈣電流再激活導致早后除極；復極后Na電流繼續(xù)增加會進一步導致晚后除極。有關報道已表明了Na通道與房顫電重構密切相關，在Na電流大小同對照組比較顯著降低〔7〕。有研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者右心耳組織快Na電流通道的表達降低，可使心肌細胞興奮性和電傳導速度均發(fā)生改變，維持房顫狀態(tài)〔8〕。可見SCN5A功能獲得性和缺失性的突變都與房顫有十分密切的聯(lián)系。由此推測，本文miR-1266術前增加，調控SCN5A表達下降，Na電流密度降低，術后則明顯逆轉。

KCNE1基因編碼的β亞單位與KCNQ1構成緩慢激活延遲整流鉀電流，即IKs電流〔9，10〕。IKs電流是心臟復極3相的重要離子流，與動作電位密切相關。因此，KCNE1表達變化或基因突變導致IKs電流發(fā)生改變，從而增加房顫易感性。Olesen等〔11〕研究指出KCNE1及其家族與房顫發(fā)生關系密切。由此推測，本文miR-1266術前增加，調控KCNE1表達變化或突變，IKS電流增加，導致動作電位(ADP)和有效不應期(AERP)縮短，房顫易感性增加，術后逆轉可能是和miR-1266明顯下降有關，ADP和AERP可能會相對延長。KCNH2定位于7號染色體上編碼心肌細胞快速激活延遲整流鉀通道(Ikr)的α亞基〔11〕。有研究證實，KCNH2編碼鉀通道Kv11.1,其獲得性和功能缺失性突變導致長、短QT綜合征，同房顫關系密切〔12〕。本文miR-1266調控KCNH2表達變化或突變，Ikr電流增加，導致ADP和AERP縮短，房顫易感性增加，術后逆轉可能是和miR-1266明顯下降有關，ADP和AERP可能會相對延長。

綜上，血漿miR-1266調控與心房電重構的病理生理改變十分相關，此外血漿miR-1266不同類型房顫之間術前和術后變化也有所差異。術前血漿miR-1266在陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫和永久性房顫中表達均上調且增幅逐漸升高。其中在永久性房顫中上升最為顯著。術后表達同術前均明顯下降，其中永久性房顫患者術后血漿miR-1266表達下降最為顯著。可以預見，隨著房顫患者發(fā)作頻率和持續(xù)時間的增加，在不同房顫類型隨著電重構變化加大，血漿miR-1266的表達會有所升高，而術后1個月電重構逐漸消失，經(jīng)過負反饋調節(jié)血漿miR-1266逐漸下降。總之，血漿miR-1266在房顫患者射頻消融術前后表達及其含量變化說明其與房顫發(fā)生發(fā)展關系十分密切，同時在不同房顫類型中血漿miR-1266表達和含量變化也存在差異。診斷時應綜合考慮患者的各方面情況，如聯(lián)合檢測多種細胞因子的水平、綜合考慮患者具體的臨床表現(xiàn)進行診斷和治療，因此可以將檢測血漿miR-1266、的表達情況和動態(tài)變化作為診斷的輔助指標。同時也可以作為一種疾病預后的指標，或是疾病嚴重程度的指標。此外，深入研究miR-1266靶基因，對房顫發(fā)病機制的調控，治療的分子靶點的研究有重大意義。