PCR相關技術在植物病毒檢測中的應用

游雨欣

摘要：由植物病毒感染引起的作物歉收是農業生產中的持續問題。為了最大程度地減少病毒造成的破壞并確保農業的可持續發展，探索快速準確的檢測方法來控制這些植物病毒非常重要。而PCR和建立在PCR基礎上的分子生物學技術以其靈敏、快速、簡便等優點在植物病害檢測中得到了廣泛應用[1]。本綜述就此著重論述PCR相關技術的多種分子生物學技術的原理及其在植物病毒檢測中的應用，并對未來研究植物病毒檢測方面做出了展望。

關鍵詞：PCR技術;植物病毒;檢測

植物病毒已經發現了一百余年，但是仍然沒有有效的方法來預防和治愈。中國有的植物病毒種類繁多，每年都會對作物的產量和質量產生重大影響。、因此，缺乏有效的控制劑會導致很高的經濟損失，建立方便，高效和快速的植物病毒檢測方法是解決問題的關鍵。

目前用于病毒檢測法主要是酶聯免疫吸附法（ELISA），盡管ELISA的檢測靈敏度遠高于傳統生物學方法，但仍存在一些難以檢測和含量少的韌皮部病毒的缺陷[2]。而PCR及其相關技術以其快速、靈敏和準確等優點已廣泛應用于植物病毒的檢測。本文評述了近年來RT-PCR技術在植物病毒檢測中應用，及以其為基礎衍生出來的一些分子生物技術，為進后續的研究提供參考價值。

1反轉錄聚合酶鏈式反應

RT-PCR已被遍及用于植物病毒疾病的檢測中，通常包含四個步驟：從待測樣品中提取病毒RNA，cDNA的逆轉錄合成，目標cDNA片段的PCR擴增以及PCR產物的電泳檢測，添加病毒的特異性引物以完成病毒的檢測[3]。葉明等[4]基于Taq聚合酶的聚合酶活性并具有逆轉錄酶活性的特征，發現僅在Taq聚合酶的作用下即可完成RT-PCR擴增。

現如今隨著分子生物學技術的不斷進步，傳統的RT-PCR檢測技術也在不斷完善，主要集中在RT-PCR反應程序和反應體系、病毒RNA的提取、PCR產物的檢測、特異性的提高等方面，也因此不斷拓寬了一系列的新方法。

1.1多重RT-PCR檢測技術

多重RT-PCR（m-RT-PCR）對常規RT-PCR反應體系進行改進，在同一RT-PCR反應體系中使用多對分別針對不同病毒的引物，在一個PCR反應中同時擴增多種病毒的基因片段，它可以同時檢測多種病毒，提高了檢測效率。m-RT-PCR也可對同一種病毒進行多重檢測，降低假陽性的出現。

張威等[5]基于馬鈴薯生產領域中發病率高、易發生復合感染的PV、PVY和PLRV病毒，建立了m-RT-PCR檢測體系。DNAstar軟件測序結果顯示，PLRV、PVY、PVS擴增產物片段大小與預期一致，序列與相應病毒序列同源性達98%以上，驗證了m-RT-PCR檢測結果的可靠性。因此，RT-PCR檢測技術真正投入實際應用的發展方向將是m-RT-PCR技術。

1.2免疫捕捉RT-PCR檢測技術

免疫捕捉RT-PCR（IC-RT-PCR）是結合免疫學和RT-PCR建立的檢測方法。IC-RT-PCR操作過程：用特異性抗體捕獲病毒顆粒后，進行熱變性，然后進行RT-PCR擴增和電泳檢測。陳建軍[6]等使用IC-RT-PCR檢測-Ⅲ葡萄葉卷曲病毒，建立IC的檢測方法，RT-PCR方法極大拓寬了病毒檢測領域，彌補了ELISA和RT-PCR以及這兩種方法的一些不足，是一種較可行的病毒檢測方法。

1.3試管捕捉-RT-PCR檢測技術

TC-RT-PCR是在普通RT-PCR的基礎上發展起來的一種新方法。它不需要提取RNA，但使用了一個病毒檢測和基因克隆技術，它結合了非特異性結合的病毒粒子與試管和RT-PCR擴增外殼蛋白，以避免RNA降解與普通RT-PCR可以獲得相同的結果，該技術已被應用于一些植物病毒的檢測。

沈建國等[7]建立了大豆種皮上BPMV的TC-RT-PCR檢測方法，既不需要特異性抗血清，也不需要提取高純度的RNA，并且避免了使用有機溶劑，并且操作簡便，因此具有良好的應用價值，不僅適合于少量大豆種子直接檢測BPMV，還可以用于ELISA試驗陽性，用于大豆種子實驗。

1.4核酸序列依賴性擴增檢測技術

NASBA最先由Guatellietal.等[8]提出，接著Compton[9]對此進行了完善，并且更進一步來系統說明。NASBA是一種基于PCR的恒溫擴增技術，適用于單鏈RNA的一步擴增和檢測。與PCR原理不同，NASBA由一對引物引導。在含有T7RNA聚合酶，RNAseH，逆轉錄酶AMV和NTP的反應系統中，核苷酸序列的等溫擴增是通過連續且均勻的體外特異性酶促反應進行的。NASBA的應用十分廣泛，常用于檢測帶有豆類病毒的草莓干痘病毒，南芥菜花葉病毒，柑桔裂皮，柑桔病毒IV，馬鈴薯葉片卷曲病毒等。

1.5 環介導等溫技術

LAMP是一種特異性，靈敏和簡單的新型核酸擴增技術，該技術是利用BstDNA聚合酶鏈置換活性提供反應動力學，在恒溫短時（30～60 min）的條件下完成目標DNA的有效擴增，反應分為兩個階段，即反應物啞鈴模板合成，循環開始時的基因擴增，延伸和循環階段[10]。

Fukuta等[11]開發了一種基于CaMV35S啟動子的LAMP檢測方法，可以檢測出0.5%?5%的轉基因大豆及其制品。孫敏[12]等使用LAMP方法檢測花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子，其靈敏度高達0.002%。

2展望

農藥的過度使用，環境變化和全球化加劇植物病毒的傳播和發展，使植物病毒的檢測變得更加重要。生物檢測簡單明了，但由病毒-宿主相互作用引起癥狀常常被混淆，因此開發出基于分子生物學的植物病毒血清學檢測方法，并已被廣泛使用，其中包括LAMP等溫核酸擴增方法，包括比常規PCR更高的PCR方法，并且作為檢測植物病毒敏感性更高的一部分。并且正在被應用。

隨著生物學的發展，植物病毒的檢測技術也在不斷發展，例如，研究了基于微流控芯片技術和microRNA深度測序技術的檢測方法或將其應用于植物病毒的檢測。研究了使用磁珠和橫流紙傳感器進行傳統免疫測定和色譜分析的反應（RPCR），它們克服了單一方法的缺點，使檢測更加高效和靈敏。為避免單一技術的缺陷，檢測結合兩種以上技術的方法越來越受到人們的重視，有望成為未來植物病毒檢測技術的主要研究方向，并成為一種強大的病毒識別工具。

References

[1]. 盧會翔等， 甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）和甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J]. 中國農業科學， 2016. 49（01）： 90-102.

[2]. 吳興泉等， 馬鈴薯病毒的RT-PCR檢測技術評述. 中國馬鈴薯[J]， 2011. 25（04）： 251-254.

[3]. 秦文韜等， 環介導恒溫擴增技術（LAMP）及其在植物病毒檢測中的研究進展. 中國農學通報[J]， 2013. 29（21）： 170-174.

[4]. 葉明等， 單酶法RTP-CR檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒. 華北農學報[J]， 2002（01）： 41-45.

[5]. 張威等， 三種馬鈴薯病毒多重RT-PCR檢測體系建立. 東北農業大學學報[J]， 2014. 45（05）： 13-18.

[6]. 陳建軍等， IC-RT-PCR檢測葡萄卷葉病毒Ⅲ的研究. 河南農業科學[J]， 2006（08）： 109-112.

[7]. 沈建國等， TC/IC-RT-PCR檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒. 福建農林大學學報（自然科學版）[J]， 2012. 41（01）： 13-17.

[8]. Guatelli， J.C.， et al.， Isothermal， in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1990. 87（19）： p. 7797-7797.

[9]. Compton， J.， Nucleic acid sequence-based amplification[J]. Nature， 1991. 350（6313）： p. 91-200.

[10]. Notomi， T.， et al.， Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic acids research， 2000. 28（12）： p. E63-E63.

[11]. Fukuta， S.， et al.， Detection of Ceratocystis Fimbriata from Fig Tree and Soil by the Loop-mediated Isothermal Amplification （LAMP） Method[J]. Research Bulletin of the Aichi-ken Agricultural Research Center， 2009（41）： p. 1-6.

[12]. 孫敏等， 花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子LAMP檢測方法的建立[J]. 食品科技， 2010. 35（04）： 255-258.