苦蕎凝集素的穩定性及體外消化性

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(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006; 2.山西大學生物技術研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西太原 030006)

凝集素是一類能與紅細胞表面特異糖基進行可逆結合并促使細胞凝集的蛋白質,在自然界廣泛分布[1]。1975年Becker等[2]首次解析了刀豆凝集素(Concanavalin A,Con A)分子的三級結構,掀起了凝集素研究的熱潮。人們對凝集素的結構、分類、糖結合特性、生物活性等進行了深入研究[3],發現凝集素在信號識別、胚胎發育、免疫應答、植物防御等多方面均有重要作用[4]。由于其特異性結合能力,凝集素已廣泛應用于分離純化、結構分析及免疫細胞化學技術,是研究細胞膜結構的有利工具,有望開發為二代生物粘附藥物傳輸系統[5]。同時,凝集素具有抗真菌、抑制HIV-1逆轉錄酶、誘導腫瘤細胞凋亡等多種能力,在全胃腸外營養期可以用于預防胃腸粘膜萎縮,還可用于開發新型減肥藥物[6]。因此,凝集素在生物、醫學及農業等多個領域應用前景廣闊[7]。然而,1988年首次發現的蓖麻凝集素具有極強的細胞毒性,大豆凝集素是大豆主要的抗營養因子,凝集素的安全性也一直是人們關注的焦點問題[8]。

苦蕎為廖科雜糧作物,藥食同源,有“五谷之王”的美稱,含有豐富的礦物質、類黃酮、抗菌肽等生物活性物質,已開發出一系列相關保健品和輔助藥物[9-10]。本課題組從苦蕎中分離純化得到一種凝集素(tartary buckwheat lectin,TBL),對其理化性質進行了初步研究[11]。TBL是一種糖結合蛋白,分子質量約為 62 kDa,特異性凝集人的O型血紅細胞,凝血活性可被D-甘露糖和D-葡萄糖抑制,具有磷酸酯酶活性和類似核糖體失活蛋白的功能。然而,作為一種抗營養因子,TBL的穩定性、消化特性等與食品安全關系密切,目前尚未有對TBL穩定性和消化性的報道。體外消化模型成本低、周期短、重復性好,是代替體內研究食品蛋白消化的一種重要手段。

本實驗采用人工胃液和腸液模擬消化模型,聯合十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳技術(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析消化后TBL蛋白條帶的變化,研究TBL的消化特性,并進一步探索TBL的pH穩定性和熱穩定性,以及熱處理對TBL消化性的影響,將為深入研究凝集素的開發應用奠定一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎種子 云蕎一號,由云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所饋贈;胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma公司;其他試劑 均為國產分析純;實驗用水 為去離子水。

BioLogic LP低壓層析系統 美國Bio-Rad公司;5804R高速冷凍離心機 德國艾本德公司;FE28-Standard精密pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;AR124CN精密電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用公司;DYCZ-24D垂直板電泳槽和電泳儀 北京六一生物科技有限公司;HH SY21-Ni恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司;HP-02無油真空泵 天津市恒奧科技發展有限公司;DEAE FF離子交換層析柱(1 mL) 美國Bio-Rad公司;透析袋(10 kDa) 生工生物工程(上海)股份有限公司;超濾濃縮管(30 kDa) 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎凝集素的制備 參考申劍等[11]方法,略作改動。稱取150 g苦蕎麥種子,粉碎,用40目篩篩選粉末,加入500 mL乙醚攪拌脫脂1 h,抽濾得到脫脂粉。稱取100 g粉末于燒杯中,加入1.5 L 浸提緩沖液(0.02 mol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液,pH4.7),4 ℃攪拌提取8 h,于4 ℃,11 000 r/min離心30 min,收集上清液。往上清液中邊攪拌邊加入硫酸銨,使其飽和度達到80%,使用磁力攪拌器繼續攪拌8 h,11000 r/min離心30 min收集沉淀。用少量平衡緩沖液(0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液PBS,pH7.0)溶解沉淀,并以相同緩沖液作為外液,使用截留分子量為10 kDa的透析袋于4 ℃進行透析,每隔30 min更換外液,并用BaCl2檢測透析外液,至無法檢測到硫酸鋇沉淀,透析結束,得到蛋白粗品。繼續使用陰離子交換層析柱DEAE FF在蛋白純化系統上進行純化,即得到苦蕎凝集素。平衡緩沖液中加入0.5 mol/L NaCl為洗脫緩沖液,流速為2 mL/min,收集洗脫峰并進行SDS-PAGE及凝血實驗鑒定。將純化的目的蛋白用超濾濃縮管(30 kDa)濃縮后,分裝于2 mL離心管中,于-20 ℃保存備用。

1.2.2 苦蕎凝集素熱穩定性研究 向1.5 mL離心管中分別加入20 μL 1 mg/mL苦蕎凝集素(溶劑為20 mmol/L PBS,pH7.0),于沸水浴中分別加熱0、10、20、30、40、50、60 min后,迅速置于冰浴中冷卻,加入SDS-PAGE樣品緩沖液(pH6.8 0.25 mol/L Tris-HCl、10% SDS、0.5%溴酚藍、50%甘油、5%β-巰基乙醇),繼續用沸水浴加熱5 min,使蛋白充分變性,與SDS結合,進一步進行SDS-PAGE分析,并按照以下公式計算保留率。

其中,A樣為不同加熱處理時間后樣品的灰度值,A0為TBL的灰度值。

1.2.3 苦蕎凝集素pH穩定性研究 將苦蕎凝集素分別于37 ℃,pH為2、4、6、8、10、12的緩沖液中處理30 min后,加入SDS-PAGE樣品緩沖液,立即沸水浴中加熱5 min,進行SDS-PAGE分析,以灰度值最大組的灰度值為100%,按照上式計算保留率。

1.2.4 苦蕎凝集素體外消化實驗 人工模擬胃液(simulated gastric fluid,SGF)根據美國藥典配制,成分為胃蛋白酶(3.2 mg/mL,1000 U/mg)和NaCl(2.0 mg/mL)的水溶液,用鹽酸調至pH1.2[13]。實驗主要按照Thomas等[14]的方法進行,并做了適當修改。在1.5 mL離心管中加入15 μL SGF,于37 ℃預熱10 min,分別加入10 μL 1 mg/mL的苦蕎凝集素,混勻,開始模擬消化,反應不同時間(0、10、20、30、40 min)后,加入5 μL終止液(20 mmol/L Na2CO3水溶液,pH11.0)終止反應。對照組的加樣順序為先向SGF中加入終止液,再加入10 μL苦蕎凝集素,以保證消化反應不會進行。向各管樣品中分別加入5 μL 6×SDS-PAGE樣品緩沖液,在沸水浴加熱5 min,進行SDS-PGAE分析。實驗分為兩組,即未經加熱的苦蕎凝集素組和預加熱組,預加熱組中樣品為沸水浴加熱處理30 min后的TBL。

人工模擬腸液(simulated intestinal fluid,SIF)為10 mg/mL胰蛋白酶溶液(pH6.8±0.1,含6.8 mg/mL KH2PO4)。分別將10 μL凝集素樣品(1 mg/mL)加入到15 μL 37 ℃預熱的模擬腸液中,反應不同時間(0、10、20、30、40、50 min)后,立即煮沸5 min終止反應。對照組(即反應0 min)的處理是先向15 μL胰蛋白酶中加入樣品緩沖液,煮沸3 min后再加入10 μL苦蕎凝集素。終止反應后分別加入5 μL樣品緩沖液,沸水浴加熱5 min后進行SDS-PAGE分析。同樣,本實驗中的樣品分為未經過加熱的TBL組和預加熱組,預加熱組中樣品為沸水浴加熱處理30 min后的TBL。

1.2.5 SDS-PAGE分析 SDS-PAGE參考Laemmli等的方法[12],采用12%分離膠和4%濃縮膠,考馬斯亮藍R250染色脫色后拍照,進行分析。

1.3 數據處理

所有實驗進行3次重復,繪圖用Origin 8.6進行,灰度分析用Image J進行。

2 結果與分析

2.1 苦蕎凝集素的純化及鑒定

苦蕎粉過脫脂、浸提、硫酸銨沉淀、透析脫鹽后,得到蛋白質粗提物,上樣于DEAE FF陰離子交換層析柱,結果如圖1所示。在洗脫時間5～15 min時出現穿透峰1。充分洗去未結合蛋白后,提高鹽離子濃度,換用含0.5 mol/L NaCl的緩沖液進行洗脫,在33～40 min出現蛋白峰,收集洗脫峰2。對峰2組分進行SDS-PAGE分析,結果見圖2A。泳道1為苦蕎粗品蛋白,條帶相對較少,說明苦蕎粉經過浸提后，便有效去除了較多的雜蛋白,有利于后續純化。本研究在前期工作的基礎上,利用苦蕎凝集素較好的穩定性,對提取工藝進行了優化,采用偏酸性緩沖液進行浸提,簡化了純化方法。泳道2為純化后的蛋白樣品,電泳結果顯示為一條帶,蛋白表觀純度達到了95%以上,根據相對遷移率和分子質量對數的回歸方程,計算出蛋白的相對分子質量為62 kDa,與預期結果一致,并經凝血實驗證明，純化的蛋白即為苦蕎凝集素[11]。

圖1 苦蕎凝集素的離子交換層析圖譜Fig.1 Ion exchange chromatography of TBL

圖2 苦蕎凝集素的SDS-PAGE分析結果Fig.2 SDS-PAGE analysis result of TBL注：1為苦蕎粗品蛋白；2為純化后蛋白。

2.2 熱處理對苦蕎凝集素的影響

將苦蕎凝集素在沸水浴中分別加熱0、10、20、30、40、50、60 min后進行SDS-PAGE,結果見圖3。加熱不同時間后,TBL的條帶仍清晰可見,但相比未加熱組(泳道1),加熱后的蛋白條帶亮度有所降低,尤其加熱50、60 min(泳道6、泳道7)后,目的條帶的變化肉眼可見。灰度掃描分析結果表明,TBL的降解與加熱時間呈線性關系,隨著加熱時間延長,降解程度升高。日常生活中,對食物的蒸煮時間為60 min左右。在本研究中,當加熱時間達60 min時,仍有50%以上TBL未發生降解。由此可見TBL對熱不敏感,較為穩定,常規的食品熱加工手段并不能完全消除TBL。

圖3 熱處理對苦蕎凝集素保留率的影響Fig.3 Effect of heat treatment on retention rate of TBL注:1～7:TBL沸水浴中分別加熱0、10、20、30、40、50、60 min。

2.3 pH對苦蕎凝集素的影響

將苦蕎凝集素在不同pH緩沖液中分別處理30 min后進行SDS-PAGE,結果見圖4。不同pH處理后,TBL電泳結果仍為一條帶,條帶的位置相同。在pH8.0時,TBL有最大保留率,當酸度為pH4.0時,TBL的保留率仍在80%左右。TBL在pH4～12環境條件均有很高的保留率,表明該蛋白具有很好的酸堿穩定性。同時,也進一步驗證了在優化提取工藝時選擇pH4.7浸提緩沖液是可取的。

圖4 pH對苦蕎凝集素保留率的影響Fig.4 Effect of pH on retention rate of TBL注:1～5:TBL分別在pH4、6、8、10、12處理30 min。

2.4 體外模擬消化實驗

苦蕎凝集素分別經體外模擬人工胃液和腸液消化后進行SDS-PAGE分析,結果如圖5和圖6所示。模擬胃液和腸液中,胃蛋白酶和胰蛋白酶的電泳條帶清晰可見(圖5、圖6)。從TBL電泳條帶可知,模擬胃液對TBL的降解作用明顯強于模擬腸液。對蛋白條帶進行灰度分析,并以模擬消化實驗中反應0 min時TBL的灰度值為100%,計算苦蕎凝集素的保留率。由圖5可知,隨著SGF處理時間延長,TBL保留率迅速降低,40 min時基本消化完全,降解一半TBL所需時間僅為10 min。由圖6可知,TBL在SIF中很難消化,即使作用時間為50 min時,TBL也未發生明顯變化(泳道8)。

圖5 苦蕎凝集素的SGF消化Fig.5 SGF digestion profiles of TBL注:1:TBL;2:模擬胃液;3～7:TBL在SGF中分別消化0、10、20、30、40 min。

圖6 苦蕎凝集素的SIF消化Fig.6 SIF digestion profiles of TBL注:1:模擬腸液;2:TBL;3～9:TBL在SIF中分別消化0、10、20、30、40、50 min。

為探索加熱過程對蛋白消化性的影響,將苦蕎凝集素加熱處理后，進行體外模擬消化實驗,SDS-PAGE結果如圖7和圖8所示。由圖7可知,加熱后的TBL在SGF中僅處理10 min后,電泳條帶基本完全消失,蛋白被消化完全。即使在SIF中的消化也非常迅速,僅處理10 min,加熱后的TBL被SIF完全降解,沒有任何可見的殘留蛋白條帶(圖8)。因此,預加熱過程可以明顯增強消化酶對TBL的降解。這一結果與黑龜豆[13]、腎小豆[15]中凝集素的消化性類似。許多豆類蔬菜不能生吃,很重要的一個原因是其含有大量凝集素,直接食用不易消化。經過100 ℃蒸煮后,蛋白對消化酶的敏感性明顯增強,易被降解消化。因此,加熱是消除抗營養因子及過敏原的一個重要控制手段。可能是由于天然凝集素形成特定的空間結構,將消化酶的識別位點折疊包圍于分子內部,不易被消化酶識別并作用。加熱后,雖然蛋白一級結構未發生改變,沒有降解,但空間結構發生較大變化,如由緊密變得更為松散,易被胃蛋白酶或胰蛋白酶識別、結合、分解。

圖7 熱處理后苦蕎凝集素的SGF消化結果Fig.7 SGF digestion profiles of the heated TBL注:1:TBL;2:模擬胃液;3～7:加熱后TBL在SGF中分別消化0、10、20、30、40 min。

圖8 熱處理后苦蕎凝集素的SIF消化結果Fig.8 SIF digestion profiles of the heated TBL注:1:TBL;2:模擬腸液;3～8:加熱后TBL在SIF中分別消化0、10、20、30、40、50 min。

3 討論與結論

本實驗對苦蕎凝集素的穩定性及體外消化性進行了初步研究。TBL對熱不敏感,沸水浴中加熱60 min時,蛋白仍可保留一半以上。同時TBL還具有很好的酸堿穩定性,在pH4～12環境條件下處理30 min時仍具有較高的保留率。天然TBL對人工胃液的消化有一定耐受性,在人工腸液中表現出更強的穩定性,即使消化時間為50 min時,TBL也未發生降解。以上結果顯示TBL具有很好的穩定性。然而,加熱處理促使TBL空間結構發生改變,使其對胃蛋白酶及胰蛋白酶的敏感性明顯增強。

作為一種抗營養因子,TBL的穩定性及消化特性與蕎麥制品的安全性息息相關。從食品加工工藝角度出發可知，經過充分蒸煮加熱處理后，有利于提高蕎麥制品的食品安全性。另外,糖及其衍生物對凝集素活力有抑制作用,如核桃凝集素的凝集活性可被N-乙酰-D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-半乳糖胺抑制[16],D-甘露糖和D-葡萄糖可抑制TBL的凝集活性。此外,由于金屬離子對凝集素的結構及結合糖的活性均有影響,失去金屬離子后凝集素穩定性降低。如Con A脫去金屬離子后,通過主鏈Ala-Asp肽鍵的順反異構,其空間結構由“鎖定”狀態轉變為“打開”狀態,使得Con A對胰蛋白酶的敏感性顯著增強[17]。同樣,使用金屬螯合劑可提高木瓜蛋白酶對加納籽II型凝集素的消化性[18]。因此,除了常規的酸堿及熱處理加工手段,是否可通過配合使用某些糖類或金屬螯合劑抑制凝集素活性以提高食品安全性,還有待進一步探索。

由于對胃腸道的消化具有一定抵抗作用,植物凝集素有望發展為二代生物粘附藥物傳輸系統,減少非特異性蛋白損失。課題組之前的研究發現,TBL識別HCT116細胞表面的galectin-3受體,通過內吞作用進入細胞,調控miR-135a&b的表達并影響Wnt信號通路,可以顯著抑制結腸癌細胞的增殖[19]。TBL具有良好的穩定性及耐消化性,具備開發成抗腫瘤藥物的優勢條件。