不同干酵母對甘蔗汁釀酒特性的影響

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(1.廣西農業科學院農產品加工研究所,廣西南寧 530007; 2.廣西農業科學院,中國農業科學院甘蔗研究中心,廣西南寧 530007)

廣西是國內最大的甘蔗種植區和產糖區,甘蔗與蔗糖產量均占全國60%左右[1]。甘蔗含糖量高,是我國主要的制糖原料,其糖分由蔗糖、果糖、葡萄糖三種主要成分構成,約占18%～20%[2]。在食品工業生產中,我國的甘蔗工業產品比較單一,主要用于制造蔗糖和直接食用。甘蔗不僅富含蔗糖,還含有豐富的維生素以及Fe、Ca、P、Mn、Zn等元素[3-4],具有獨特的甘蔗清香,是釀造果酒的良好原料。

研究發現,直接利用甘蔗汁中蔗糖分可以發酵制成不同產品,如甘蔗朗姆酒[5]、甘蔗果酒[6-7]、甘蔗醋[8-9]等。果酒發酵過程中,酵母菌起關鍵作用,發酵能力的好壞、副產物的多少,直接影響酒精生產率的高低,間接影響產品的風味品質[10]。酵母菌種類不同,同種原料發酵其生理特性也存在差異,如生長曲線、產酒精能力等[11]。近年來,已有不少甘蔗汁發酵酵母篩選、工藝方面的研究[12-14],但有關酵母菌在甘蔗汁中的發酵特性等報道較少,多數集中于啤酒發酵的研究[15-17]。

本研究是在前期試驗的基礎上,篩選出三種不同商用活性干酵母,對新鮮甘蔗汁進行發酵,探討三種酵母菌發酵作用甘蔗汁的生長曲線、凝聚性、發酵度、發酵力、酸化力和產酒精能力等釀酒特性,以期為甘蔗汁發酵制備甘蔗果酒的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗 新臺糖22號,新鮮全莖蔗,無腐爛霉變,由廣西農業科學院甘蔗研究所提供;葡萄酒高活性干酵母、耐高溫高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;發利干酵母 英聯馬利(北京)食品銷售有限公司,均為市售;乙酸、乙酸鈉、無水硫酸鈣、EDTA-Na、葡萄糖 均為分析純。

YZ220×300甘蔗壓榨機 文山通用機械制造有限責任公司;搖床、高速離心機 上海博訊實業有限公司;BIC-300人工氣候箱 上虞艾科儀器設備有限公司;JY6002型電子天平、JA2003型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;101-2AB型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;WJ-3A三孔獨立控溫水浴鍋 常州偉嘉;pHS-3C酸度計 上海雷磁儀器廠;酒精計 北京克格儀器有限公司;PAL-1糖度計 日本ATAGO(愛拓)公司;Salvis LAB CN118恒溫生物培養箱 瑞士Salvis公司;WU-CJ-FD潔凈工作臺 蘇州蘇杰凈化設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甘蔗汁和酵母培養液的制備 甘蔗汁:新鮮甘蔗經甘蔗壓榨機二次壓榨,混合均勻,120目過濾除雜得到甘蔗汁,備用。

酵母培養液:分別取葡萄酒高活性干酵母、耐高溫高活性干酵母與發利干酵母三種酵母菌各0.050 g于100 mL無菌水中,置于180 r/min、30 ℃搖床培養10 h使之活化得到培養液,備用。

1.2.2 酵母生長曲線的測定 在無菌操作條件下,取171支無菌的50 mL試管分為A、B、C三組(各組57支待試試管),各組分別加入滅菌的甘蔗汁(含20%無菌水)20 mL,1 mL各種酵母培養液,搖勻后置于180 r/min,30 ℃的恒溫搖床上培養,從0 h開始,每2 h取各組待試酵母培養液5 mL稀釋10倍,在560 nm下測定OD560值,以未接種的甘蔗汁為校正比色計的零點,至培養36 h結束。每個測定值取3個平行點(即取3支待試試管)測定數據,取其平均值,根據OD值繪制酵母菌生長曲線。

1.2.3 酵母凝聚性的測定 酵母凝聚值采用光密度改良法測定[18]。取初始表觀糖度為22 °Bx的甘蔗汁1500 mL,滅菌后分別加入葡萄酒高活性干酵母、耐高溫高活性干酵母與發利干酵母三種酵母培養液,在溫度25 ℃條件下靜置發酵。每隔24 h取發酵液于離心機以8000 r/min常溫下離心10 min,至發酵結束。沉淀即為酵母泥,收集為待用酵母泥。取待用酵母泥用20 mL EDTA-Na溶液(0.01 mol/L)洗滌1次后,于離心機以3500 r/min常溫下離心10 min,棄去上清液,余下酵母泥再用50 mL去離子水洗滌、常溫下離心2次(3500 r/min,10 min)后,收集酵母泥為備用酵母泥。稱取1.0 g備用酵母泥,轉移至50 mL帶塞離心管中,加入乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.5,0.2 mol/L)定容至50 mL,在振蕩器上振蕩5 min后,即刻取4.0 mL于670 nm分光光度計下測光密度OD值。同時將離心管靜置于20 ℃水保溫30 min,在距液面下1 cm處吸取4.0 mL于670 nm分光光度計下測定光密度OD1,以pH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液為空白對照。

計算公式:酵母凝聚值F(%)=(OD-OD1)/OD×100

1.2.4 酵母發酵力的測定 酵母發酵力采用CO2失重法測定[19-20]。在專用發酵瓶中加入150 mL初始表觀糖度為22 °Bx的甘蔗汁,分別加入3 mL各種酵母培養液,接種完畢后,蓋上發酵栓,25 ℃下恒溫靜置發酵,稱重發酵瓶。后每隔24 h稱重一次,稱重前先搖晃發酵瓶以排去發酵醪液中的CO2,直至CO2失重<0.2 g,發酵視為結束,以CO2失重為縱坐標,發酵時間為橫坐標,繪制發酵速率曲線。

1.2.5 酵母發酵度的測定 在專用發酵瓶中加入150 mL初始表觀糖度為22 °Bx的甘蔗汁,分別加入3 mL各種酵母培養液,接種完畢后,蓋上發酵栓,恒溫25 ℃下靜置發酵10 d,酒精度無變化視為結束。取發酵液常溫下離心(4000 r/min,15 min)后濾去酵母得到上清液。取50 mL上清液微火熱蒸至原容積的1/3以便除去乙醇,添水恢復原容積后,冷卻20 ℃下用糖度計測定糖濃度W1。同時用糖度計直接測定20 ℃下上清液的糖濃度W2。

按下列計算公式計算[21]:

真正發酵度:Wr(%)=(W-W1)×100%/W

外觀發酵度:Wa(%)=(W-W2)×100%/W

式中:W-發酵液初始糖度(%);W1-發酵后排除酒精后的發酵液濃度(%);W2-發酵結束后直接用糖度計直接測定室溫20 ℃下發酵液的糖度(%)。

1.2.6 酸化力的測定 采用酸化力AP值法測定酵母活力,參考文獻[22]方法并稍作改進。取1.2.3待用酵母泥用4 ℃去離子水洗滌常溫下離心(3500 r/min,10 min)3次,收集沉淀酵母泥備用。稱取1.0 g沉淀酵母泥于100 mL器皿中,加入25 ℃蒸餾水50 mL,以150 r/min攪拌10 min,隨后在酵母懸浮液中加入5 mL葡萄糖溶液(20.2%,w/v),持續攪拌至20 min時將pH計插到懸浮液中測定pH20,后每隔24 h測定一次,至發酵結束。

酸化力(Acidification power,AP)計算公式:AP=6.3-pH20(6.3為水的pH)。

1.2.7 產酒精能力的測定 采用蒸餾法測定[23]。取甘蔗汁,在初始表觀糖度為22 °Bx、酵母添加量為0.5 g/L(質量濃度)、溫度25 ℃條件下靜置發酵,酒精度無變化視為結束。每隔24 h取100 mL發酵液于蒸餾瓶中,同時加入100 mL水,混合搖勻后進行蒸餾。當置冷凝管下端收集餾出液100 mL,停止蒸餾,搖勻備用。將酒精計和溫度計緩慢置入蒸餾液中,測定溫度和酒精度,查表校正為20 ℃時的酒精度。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel 2003進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 酵母菌的生長曲線

試驗測定三種酵母菌的生長曲線,觀察其生長狀況。預實驗結果發現,培養10 h后,測定的OD560值大于1.20,改進方法再次稀釋10倍后,測定OD560值,其結果見圖1。

由圖1可以看出,0～4 h是三種酵母菌的延緩期,對數生長期為4～18 h,穩定期為18～28 h,28 h后酵母菌開始進入衰亡期。從酵母菌OD值變化可以看出，三種酵母菌生長曲線的趨勢基本一致，其中，葡萄酒高活性干酵母在對數生長期和穩定期均表現良好。付滿[24]研究采用安琪葡萄酒酵母進行蔗稍汁釀酒的結果也顯示,延緩期內葡萄酒酵母的活性較大,能夠快速適應甘蔗汁的營養成分快速起酵,有較好的啟發性能,且最早達到對數增長末期。葡萄酒酵母表現出良好的發酵性能,發酵過程也較平緩,穩定期長,降糖平穩。本研究從OD值大小及酵母菌生長曲線的趨勢,特別是在對數生長期和穩定期的變化趨勢,可以看出三種酵母菌的生長穩定性為葡萄酒高活性干酵母>耐高溫高活性干酵母>發利干酵母。

圖1 不同酵母菌的生長曲線Fig.1 The growth curves of different yeasts

2.2 凝聚性的變化

酵母的凝聚性是酵母菌生理特征之一,每一酵母菌均有自身的特定的凝聚性。凝聚性強的酵母,發酵結束時沉降早、效率快,發酵繆液中酵母細胞數少,能大大降低酵母長時間懸浮于發酵液中造成自溶的趨勢;凝聚性差的酵母,發酵結束時沉降晚、效率慢,酵母細胞仍懸浮于發酵液中,易造成酵母細胞自溶,酵母發酵泥回收量低,增加濾酒難度,給生產帶來不便[25]。凝聚值(F值)表示酵母的凝聚程度,凝聚值大小不同,代表酵母的凝聚作用力也有差距,其中F<20%為非凝聚酵母,20%≤F≤80%為中凝聚酵母,F>80%為高凝聚酵母[26]。

三種酵母菌在甘蔗汁的凝聚值變化見圖2。從圖2可知，發酵48～96 h時,三種酵母菌的凝聚值變化較大,在第72 h時呈現增強的波峰,葡萄酒高活性干酵母的F值為22.11%,可能是因為發酵過程中酵母處于比較旺盛的生理狀態,在一定程度上增強了凝聚性[27],而在其他發酵時間段酵母菌的凝聚性均為F<20%,當發酵時間≥96 h時,隨著發酵時間的延長,酵母凝聚值逐漸降低,其凝聚作用也逐漸減弱。綜合甘蔗汁的發酵過程變化來看,三種酵母的凝聚值F<20%,均為非凝聚性酵母。

圖2 不同酵母菌在甘蔗汁中凝聚性的變化Fig.2 The change of coagulability of different yeasts in sugarcane juice

2.3 發酵力的變化

酵母菌發酵作用甘蔗汁產生酒精,與之同時還伴有CO2的生成,形成的CO2從發酵醪液中排出,使整個發酵醪液體系的重量不斷減輕,直至發酵結束后保持重量不變[20]。根據發酵液失重的程度,可測定發酵速率的快慢。發酵力可反映出待篩選酵母的起酵時間、對甘蔗汁的適應性、發酵強度及發酵過程的動態變化[15]。三種酵母菌的發酵力變化見圖3。

由圖3可知,在發酵過程的前48 h,三種酵母菌的CO2失重量變化最大,說明這一階段發酵速度快,酵母菌處于繁殖旺盛期,發酵能力強,其中發利干酵母的發酵速度慢于葡萄酒高活性干酵母和耐高溫高活性干酵母;發酵72 h后三種酵母菌的發酵速度明顯降低,發酵96 h后三種酵母菌發酵過程趨于平緩,發酵基本結束。姜加良[28]研究傳統釀造糯米酒中酵母菌的發酵特性也表明,發酵的產物之一是CO2,試驗中產生的氣泡數量越多,氣泡體積越大,酵母的發酵能力越強,酵母的發酵速率越快,酵母的發酵程度越徹底。從總趨勢來看,三種酵母菌發酵前48 h階段的起酵速度和發酵力有一定的差異,但在發酵72 h后時,三種酵母菌的發酵力是相當的。

圖3 不同酵母菌對甘蔗汁的發酵力變化Fig.3 Change of fermentation ability of sugarcane juice with different yeasts

2.4 發酵度的變化

不同釀酒酵母的菌株在代謝過程中存在差異性,對可發酵性糖的利用程度也不同。三種酵母菌作用甘蔗汁后的發酵度變化如圖4所示。從圖4可知,三種酵母菌的真正發酵度都達到70%以上,但都低于各自的外觀發酵度,這與張帥等[21]研究蘋果皮中分離到的3種酵母菌的發酵性能結果相類似。這是因為外觀發酵度測定時不考慮酒精、CO2對發酵的影響,是以糖度計實測外觀殘留濃度計算的,所以測得的發酵度值比真正發酵度要高。綜合總體來看,三種酵母菌作用甘蔗汁中的發酵度高低順序為:葡萄酒高活性干酵母>發利干酵母≥耐高溫高活性干酵母,這也說明葡萄酒高活性干酵母對可發酵性糖利用率最高,發酵后得到的酒精度也會較高。

圖4 不同酵母菌對甘蔗汁的發酵度變化Fig.4 Change of fermentation degree of sugar cane juice with different yeasts

2.5 酸化力的變化

酸化力(AP)法是在酵母懸液中加入葡萄糖前后測定pH的變化,這種變化與酵母活性及發酵性能有關。酵母活力AP值一般為0.15～3.0,AP值愈大,酵母活力愈強,健康強壯的酵母AP值≥2.5,活性較差的酵母AP值一般<1.5。通過測AP值的高低可以判定酵母活力的強弱,對酵母的發酵性能有較好的預測作用[29]。但此法中添加的是葡萄糖,相同活力的不同酵母菌株對葡萄糖的代謝能力不同[16]。三種酵母菌不同時間下的酸化力AP值結果見圖5。

從圖5可知,在發酵過程中,發酵1～3 d時,三種酵母菌的AP值降低幅度最大;3～6 d期間,AP值處于波動變化,發酵6～8 d時,AP值逐漸上升至平穩。從發酵開始到發酵結束AP值的變化是先降低再持續平緩后上升的過程。AP值降低主要是因為CO2的產生和H+的釋放,此外產生的CO2和釋放的H+作為細胞內能量被利用會使酵母的活力下降[30]。郭曉明等[31]比較了4種干酵母對香蕉果酒的發酵特性研究也認為,安琪葡萄酒干酵母優于其它干酵母,發酵過程中酒精度增加速度均較快,在高糖度條件下發酵能力最好。從三種酵母菌發酵后期的酸化力的大小來看,葡萄酒高活性干酵母優于耐高溫高活性干酵母和發利干酵母。

圖5 不同酵母菌的酸化能力比較Fig.5 Comparison of acidification ability of different yeast

2.6 產酒精能力的變化

甘蔗果酒生產中,酒精是酵母利用發酵性糖而產生的,因此把利用發酵性糖發酵生成酒精的能力作為衡量優良酵母的一項重要指標[12],不同釀酒酵母菌株對可發酵性糖的利用程度不同,最終會導致酒精生成率有較大差別[19]。由圖6可知,三種酵母菌的產酒精能力均隨著發酵時間的增加而增強,當發酵48～96 h時,葡萄酒高活性干酵母產酒精能力明顯強于耐高溫高活性干酵母和發利干酵母;當發酵時間>120 h時,三種酵母菌產酒精能力的趨勢相當,當發酵>216 h時,酵母菌產酒精能力趨于平穩,發酵視為結束。郭曉明等[31]研究同時認為,在發酵過程中,不同干酵母發酵的發酵液酒精度呈現逐漸上升的趨勢。因此，不同干酵母生成乙醇的速度各不相同,安琪葡萄酒干酵母酒精生產速度較快,發酵結束后酒精度較高。

圖6 不同酵母產酒精能力的比較Fig.6 Comparison of ethanol production by different yeasts

本研究中,從各發酵階段及總產酒精量來看,三種酵母菌最終產酒精的能力基本相當,其中葡萄酒高活性干酵母產酒精為12.2%vol,略優于耐高溫高活性干酵母和發利干酵母(12.0%vol)。這也驗證了2.4研究結果,葡萄酒高活性干酵母在代謝過程中對可發酵性糖的利用程度較高些,發酵后得到的酒精度也會相對較高些。付滿[24]研究結果也驗證了采用安琪葡萄酒酵母對蔗稍汁進行發酵釀酒,酒精得率高。

3 結論

通過研究探討葡萄酒高活性干酵母、耐高溫高活性干酵母和發利干酵母三種商業酵母菌對甘蔗汁發酵的釀酒特性分析得到,三種酵母菌作用甘蔗汁的發酵過程中,酵母菌生長曲線趨勢基本一致,三種酵母的凝聚值F<20%,均為非凝聚性酵母。從OD值、AP值大小及酵母菌生長曲線來看,三種酵母菌的生長穩定性和酸化力大小順序為葡萄酒高活性干酵母>耐高溫高活性干酵母>發利干酵母。綜合發酵度、發酵力和產酒精能力三個方面來看,三種酵母菌作用甘蔗汁的發酵強弱順序為葡萄酒高活性干酵母>發利干酵母≥耐高溫高活性干酵母。三種酵母菌的發酵力基本相當,最終產酒精的能力差距不大,其中葡萄酒高活性干酵母最終產酒精為12.2%vol,耐高溫高活性干酵母和發利干酵母均為12.0%vol。綜上，三種商用酵母菌作用甘蔗汁的發酵過程及其釀酒特性存在一定的差異,葡萄酒高活性干酵母略優于耐高溫高活性干酵母、發利干酵母三種酵母菌。三個酵母菌發酵得到的甘蔗果酒酒精度基本相當,但如何選用適合釀制甘蔗果酒的優勢菌種,下一步將分析不同酵母菌株發酵果酒香氣成分,結合感官閾值以及感官分析評價的結果等,連同甘蔗果酒的營養品質、口感風味等因素進行綜合考慮與評判。