不同方法誘導大鼠非酒精性單純性脂肪肝模型的CYP酶活性比較研究

金 毅，邢 偉，呂愛貞，張金龍，楊 雯，徐愉林，王 茜，李 靜

(1.深圳市藥品檢驗研究院(深圳市醫療器械檢測中心)深圳藥品質量標準研究重點實驗室，廣東 深圳 518057；2.廣東東陽光藥業有限公司，廣東 東莞 523000)

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝損傷，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFL)，非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以及相關肝硬化和肝細胞癌[1-2]。隨著發病率的增加和年輕化趨勢，已成為全球重要的公共健康問題。NAFL被認為是早期病理過程，發展為肝硬化和肝癌的比例分別為5%～10%和1%～2%[1,3-4]。

目前國際公認的NAFL指標中，肝臟組織學表現符合單純性脂肪肝診斷標準即可診斷，其病理特征主要為肝腺泡3區大泡性或以大泡為主的混合性肝細胞脂肪變[1, 5-8]。

肝臟是藥物體內代謝的重要器官，而細胞色素P450酶(CYP450)是參與藥物Ⅰ相代謝反應的主要超家族酶系，廣泛參與脂肪酸、類固醇、膽酸、前列腺素、白三烯、生物胺以及類維生素等物質的生物合成和代謝，與內外源性的物質代謝密切相關[9]。通過評價NAFLD模型大鼠體內CYP酶活性，對研究脂肪肝等肝疾病及合理用藥治療肝病具有潛在意義。CYP450酶系已明確的有18個家族，43個亞家族。參與藥物代謝的家族主要有CYP1，CYP2和CYP3，其中CYP1A2、2B6、2C9、2D6和3A4共同參與了約95%以上的經CYP酶催化的臨床藥物的代謝。在肝硬化模型中大鼠的肝微粒體CYP總量明顯降低，肝損傷大鼠模型中CYP3A基因表達量會減少等幾種亞酶活性變化情況，但是，未找到CYP1A2、2B6、2C9、2D6和3A4活性變化在NAFL動物模型研究數據[10-13]。

國內外研究CYP450酶活性的方法有很多，主要包括體內和體外兩大方面。其中體外的研究方法有肝微粒體孵育法、肝S9孵育法、藥物探針法等。肝微粒體和肝S9均是肝細胞中內質網的亞細胞組分，含有豐富的藥物代謝酶P450酶，是肝勻漿液經過不同離心速度得到的組分。與肝微粒體制備對比，肝S9所需的離心速度較低，是肝勻漿液去線粒體的上清液，組分中含有的代謝酶種類也更多，包括各種I相代謝酶和II相代謝酶，添加NADPH(還原型輔酶II)，可以檢測I相代謝酶。目前肝S9系統在藥代動力學方面、毒理學和藥物相互作用等方面應用比較廣泛[14]。

鑒于目前尚未見對CCl4或高脂飼料誘導的大鼠NAFL模型CYP酶活性方面的比較研究報道，本研究采用大鼠肝S9孵育體系法探討CCl4和高脂模型2種因素誘導的大鼠NAFL模型中主要CYP酶活性的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體重160～180 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質量合格證號：43004700035137，生產許可證號[SCXK(湘)2016-0002]；動物使用許可證號[SYXK(粵)2014-0135]。動物飼養于廣東東陽光藥業有限公司東陽光研究院屏障環境動物實驗室，在20℃～26℃溫度和40%～70%濕度下飼養，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明，嚴格按照SPF級動物實驗室標準操作規程(SOP)規范操作[15](實驗動物福利倫理審查號 IAEC-K-170712-01)。

1.2 主要試劑與儀器

高脂飼料(為自擬高脂飼料配方，具體成分為：基礎飲料：50%，豆粉：12.5%，蛋黃粉：12.5%，豬油：10%，蔗糖：10%，奶粉：5%，濃魚肝油：1/100 g。委托廣東省醫學實驗動物中心配制)；非那西汀購自阿拉丁(批號：WXBC1218V)、雙氯芬酸鈉(批號：100334-200302)購自中國食品藥品檢定研究院；丁呋洛爾購自TRC(批號：1-EJB-67-6)、安非他酮(批號：100671-200301)購自中國藥品生物制品檢定所，紫杉醇(批號：130326)購自上海康標化學有限公司，0.01 mol/L Tris-HCL緩沖鹽(批號：批號ST774)購自碧云天。色譜純甲醇與乙腈購自SPECTRUM，色譜純甲酸和甲酸銨購自阿拉丁，其余試劑為色譜純，其余試劑詳見參考文獻[15]。

IKA T10B 手持勻漿機(德國IKA公司)；冷凍研磨儀(上海靜信實業發展有限公司)；Eppendorf 5810R冷凍離心機(德國Eppendorf 公司)；AB sciex 4500質譜儀(美國AB SCIEX公司)；Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；其余儀器見[15]。

1.3 實驗方法

1.3.1 兩種大鼠NAFL模型的建立

實驗動物分為CCl4模型組和溶媒組，CCl4模型組大鼠每周2次皮下注射CCl4(40%，四氯化碳溶于橄欖油)，給藥量為2 mL/kg，溶媒組平行處理，背部皮下注射橄欖油，直至實驗結束。用于實驗4周，6周和9周剖殺的CCl4模型組和溶媒組動物數量分別為：5只，5只；5只，5只；10只，10只。

高脂模型組及空白對照組，每組各10只。高脂模型組每天給予高脂配方飼料，空白對照組給予正常飲食喂養。

根據筆者前期多次實驗確認皮下給予CCl4造模4周造模成功，故設置的第一個時間點為4周；文獻中，高脂飼料喂養大鼠實驗多選擇8周確認造模成功，根據筆者經驗，將高脂飼料造模的時間點設置為9周，以便與CCl4模型形成相似的肝細胞脂肪變性為主的病理學改變，在病理基本相近或相似的基礎上比較肝臟微粒體CYP酶活性變化特點[16-17]。此外，考慮主要實驗目的及周期，為觀察CCl4模型在不同時間點CYP酶活性特點，本課題組把CCl4模型實驗的結束時間點設置為9周。

實驗結束時，大鼠禁食不禁水16 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)麻醉，處死。

1.3.2 大鼠肝S9制備

分別于CCl4造模4周、6周、9周，高脂造模9周，取邊長3 mm的新鮮肝組織，用冰水冷卻的生理鹽水沖洗凈，保存于-80℃，用于制備肝S9。

制備肝S9時，稱取500 mg大鼠肝組織于5 mL離心管中，于冰上剪碎肝組織，按1∶3(W∶V)比例加入勻漿液(0.25 mol/L蔗糖、0.01 mol/L Tris-HCl和1 mmol/L EDTA，pH=7.4)，用手持勻漿機于冰上以6000 r/min勻漿1 min，將勻漿后的混合液轉入2 mL離心管中，9000 r/min，4℃離心30 min，每管取200 μL上清液用于實驗[12]。

1.3.3 肝S9體外溫孵孵育系統條件

肝S9體外溫孵優化后系統包括30 μL大鼠肝S9(對上述制備的S9用磷酸鉀緩沖液稀釋100倍)，15 μL探針底物溶液(1A2底物非那西汀濃度120 μmol/L、2B6底物安非他酮濃度40 μmol/L、2C9底物雙氯芬酸鈉濃度40 μmol/L、2D6底物丁呋洛爾濃度40 μmol/L、3A4底物睪酮濃度320 μmol/L)預孵10 min，于各孔加入15 μL 8 mmol/L NADPH，37℃(pH=7.4)共孵育45 min后，加入150 μL乙腈(含100ng/mL普萘洛爾)終止反應，4000 r/min，4℃離心5 min取上清100 μL加水100 μL混勻，用于樣品分析。

1.3.4 檢測條件

色譜柱：ACE Excel3 C18-Amide(50×2.1 mm)，流速0.4 mL/min，柱溫40℃，A相(水+2 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸)，B相(甲醇+2 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸)，梯度為B相0～0.8 min，2%～2%；0.8～1.0 min，2%～85%；1.0～2.8 min，85%～90%；2.8～2.9 min，90%～2%；2.9～3.8 min，2%～2%。ESI+(電噴霧離子源)，霧化氣(N2)壓力55 psi，源溫度550℃。選擇正離子方式檢測，檢測電壓5500 V，采用多反應監測(MRM)方式進行定量。內標普萘洛爾離子對(Q1/Q3)為260.2/116.1、1A2探針底物代謝物Q1/Q3為152.1/110.0、2B6探針底物代謝物Q1/Q3為256.1/238.0、2C9探針底物代謝物 Q1/Q3為312.0/231.2、2D6探針底物代謝物 Q1/Q3為278.4/186.3、3A4探針底物代謝物 Q1/Q3為305.0/269.2。

1.3.5 ALT，AST檢測

腹主動脈采血，室溫放置2 h后4℃、3000 r/min，離心15 min，取血清，采用常規生化方法檢測ALT、AST。

1.3.6 肝臟甘油三酯及膽固醇的檢測

剪取新鮮肝臟部分左大葉，稱取約20 mg肝組織，用無水乙醇勻漿，離心取上清，測TG及CHO的濃度，計算肝內TG及CHO的含量，詳見參考文獻[15]。

1.3.7 組織病理學檢查

福爾馬林固定肝組織，7 d。常規脫水浸蠟后，HE染色制片，光學顯微鏡下觀察。

1.4 統計學方法

注：A：溶媒組肝臟(4周)；B：CCl4模型組肝臟(4周)；C：CCl4模型組肝臟(6周)；D：CCl4模型組肝臟(9周)。圖1 CCl4誘導的NAFL模型大鼠在4，6，9周的組織病理學改變(×200，HE染色)Note. A: Liver of the vehicle control group(week 4); B: Liver of the NAFL model group established by CCl4 (week 4); C: Liver of the NAFL model group established by CCl4 (week 6); D: Liver of the NAFL model group established by CCl4 (week 9).Figure 1 Histopathological changes in the NAFL rats established by CCl4 at weeks 4, 6, and 9 (HE staining)

2 結果

2.1 病理學確認CCl4造模成功

NAFL模型組與溶媒組比較，肝臟表面色澤發黃，體積、重量增加。組織病理學觀察，溶媒組未見異常(圖1A)，模型組第4周主要病變為肝細胞大泡性脂肪變性(圖1B)，第6、9周可見肝組織以大泡性脂肪變性為主，偶見炎細胞浸潤灶(圖1C，1D)。

2.2 病理學確認高脂造模成功

大體觀察，與空白對照組比較，模型組肝臟表面發黃，重量增加。組織病理學觀察，空白對照組肝臟未見異常(圖2A)，模型組為以大泡性脂肪變為主的病變(見圖2B)。

2.3 2種模型動物肝臟脂質含量及肝腦比均有顯著增加

CCl4模型組大鼠在實驗第4，6和9周與各自的溶媒組比較，肝內TG、CHO含量及肝腦比明顯增加，有統計學意義(表1)；與空白對照組相比，高脂模型組動物肝內TG、CHO含量及肝腦比增加，有統計學意義(表2)。

注：A：空白對照組肝臟；B：高脂飼料誘導NAFL模型組肝臟(9周)。圖2 高脂飼料誘導的NAFL模型大鼠的組織病理學改變(HE染色, ×100)Note. A: Liver of the control group; B: Liver of the NAFL model group established by a high fat diet (week 9).Figure 2 Histopathological changes in the NAFL rats established by a high fat diet (HE staining)

組別Group肝甘油三酯(mg/g) TG 肝膽固醇(mg/g) CHO 肝重 (g) Liver weight腦重(g) Brain weight肝腦比 Liver index溶媒組 Vehicle group 26.5±7.13.6±0.511.7±0.42.1±0.15.6±0.2CCl4模型組(4周)NAFL group established by CCl4(week 4)235.8±45.0***8.0±1.0***16.3±3.9*2.0±0.18.0±1.9*CCl4模型組(6周)NAFL group established by CCl4(week 6)81.8±23.4**5.9±0.9*15.3±1.6**2.0±0.27.8±0.8**CCl4模型組(9周)NAFL group established by CCl4(week 9)205.5±50.4***7.7±2.1**22.9±1.6***2.1±0.111.1±0.9***

注：與溶媒組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Note. Compared with vehicle group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

表2 高脂飼料誘導NAFL實驗中各組大鼠肝脂質，臟器重量，肝指數變化Table 2 Changes of liver lipids, organ weight, and liver index in each group of NAFL rat models established by a high fat diet

注：與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。

Note. Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

表3 CYP450底物和代謝產物Table 3 CYP450 substrate and metabolites

2.4 色譜行為

本研究采用文獻報道的特異性底物研究主要CYP酶的代謝，底物總結見表3；各底物的代謝物色譜行為顯示，各底物代謝物色譜峰不受內源性物質干擾，基線平穩，本方法具有一定的專屬性和特異性(圖3)。

注：A：空白S9樣品中1A2代謝物離子通道色譜圖；B：空白S9樣品中2B6代謝物離子通道色譜圖；C：空白S9樣品中2C9代謝物離子通道色譜圖；D：空白S9樣品中2D6代謝物離子通道色譜圖；E：空白S9樣品中3A4代謝物離子通道色譜圖；F：空白S9樣品中內標普萘洛爾離子通道色譜圖；G：S9樣品加底物孵育后1A2代謝物離子通道色譜圖；H：S9樣品加底物孵育后2B6代謝物離子通道色譜圖；I：S9樣品加底物孵育后2C9代謝物離子通道色譜圖；J：S9樣品加底物孵育后2D6代謝物離子通道色譜圖；K：S9樣品加底物孵育后3A4代謝物離子通道色譜圖；L：S9樣品加底物孵育后內標普萘洛爾離子通道色譜圖。圖3 各CYP酶底物代謝物LC/MS/MS色譜圖Note. A: Chromatogram of the 1A2 metabolite ion channel in the control S9 sample; B: Chromatogram of the 2B6 metabolite ion channel in the control S9 sample; C: Chromatogram of the 2C9 metabolite ion channel in the control S9 sample; D: Chromatogram of the 2D6 metabolite channel ion in the control S9 sample; E: Chromatogram of the 3A4 metabolite ion channel in the control S9 sample; F: Chromatogram of the internal standard propranolol ion channel in the control S9 sample; G: Chromatogram of the 1A2 metabolite ion channel in the S9 sample plus substrate after incubation; H: Chromatogram of the 2B6 metabolite ion channel in the S2 sample plus substrate after incubation; I: Chromatogram of the 2C9 metabolite ion channel in the S9 sample plus substrate after incubation; J: Chromatogram of the 2D6 metabolite ion channel in the S9 sample plus substrate after incubation; K: Chromatogram of the 3A4 metabolite ion channel in the S9 sample plus substrate after incubation; L: Chromatogram of the internal standard propranolol ion channel in the S9 sample plus substrate after incubation.Figure 3 LC/MS/MS chromatogram of each CYP enzyme substrate metabolites

2.5 CCl4誘導的NAFL模型中，主要CYP酶活性均下降

模型組與溶媒組比較，亞酶CYP1A2、2B6、2C9、2D6、3A4酶活性均有不同程度下降，以CYP1A2、2C9、2D6、3A4從第4周起，下降顯著(P<0.001)(圖4A,C-E)，CYP2B6則第6周起下降顯著(見圖4E)。

2.6 高脂飼料誘導的NAFLD模型中，主要CYP酶活性無明顯變化

CYP各亞酶活性在模型組與空白溶媒組比較，CYP1A2， CYP3A4 可見輕度上升，CYP2D6基本沒有改變，CYP2B6和CYP2C9可見下降，但均無統計學意義(見圖5)。

2.7 CCl4誘導的NAFL模型中，ALT和AST均有顯著升高

主要反映肝臟功能的ALT和AST在CCl4誘導的NAFL模型與各自的溶媒組比較，在3個時間點(4周，6周，9周)均有明顯增加，具有統計學意義(圖6)。

注：A：CCl4誘導大鼠NAFL模型中CYP1A2酶活性變化；B：CCl4誘導大鼠NAFL模型中CYP2B6酶活性變化；C：CCl4誘導大鼠NAFL模型中CYP2C9酶活性變化；D：CCl4誘導大鼠NAFL模型中CYP2D6酶活性變化；E：CCl4誘導大鼠NAFL模型中CYP3A4酶活性變化。模型組與同一時間點溶媒組比較對比，***P<0.001。圖4 CCl4誘導的大鼠NAFL模型中CYP酶活性變化Note. A: Changes of CYP1A2 enzyme activity in the rat NAFL model established by CCl4; B: Changes of CYP2B6 enzyme activity in the rat NAFL model established by CCl4; C: Changes of CYP2C9 enzyme activity in the rat NAFL model established by CCl4; D: Changes of CYP2D6 enzyme activity in the rat NAFL model established by CCl4; E: Changes of CYP3A4 enzyme activity in the rat NAFL model established by CCl4. Compared with the vehicle group, ***P< 0.001.Figure 4 Changes of CYP enzyme activity in the NAFL rat models induced by CCl4

圖5 高脂飼料誘導的大鼠NAFL模型中CYP酶活性變化Figure 5 Changes of CYP enzyme activity in the NAFL rat models established by a high fat diet

注：A：CCl4誘導大鼠NAFL模型中ALT變化；B：CCl4誘導大鼠NAFL模型中AST變化。模型組與同一時間點溶媒組比較對比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖6 CCl4誘導的大鼠NAFL模型中ALT，AST的變化Note. A: Changes of ALT in the rat NAFL model established by CCl4; B: Changes of AST in the rat NAFL model established by CCl4. Compared with the vehicle group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.Figure 6 Changes of ALT and AST in the NAFL rat models established by CCl4

圖7 高脂飼料誘導的大鼠NAFL模型中ALT，AST變化Figure 7 Changes of CYP enzyme activities in NAFL rats established by a high fat diet

2.8 高脂飼料誘導的NAFLD模型中，ALT和AST無明顯變化

ALT和AST在高脂飼料誘導9周的NAFL模型與空白對照組比較，無明顯變化(圖7)。

3 討論

NAFL是由單個或多個因素引起的以甘油三酯為主的脂類物質在肝細胞中蓄積，其發病機制尚未研究透徹，包括NAFL在內的NAFLD的治療目前還缺乏有效的方案和藥物。NAFL導致肝臟對肝損傷因素的抗力降低，特別是對肝毒性物質、肝臟的缺血、缺氧等耐受性下降。研究不同肝損傷機制誘導的大鼠NAFL模型中CYP酶活性，有助于NAFL發病機制的探索，為NAFL的治療提供基礎研究數據，具有一定的參考價值。

CYP450超家族中，CYP1A，CYP2C和CYP3A是參與藥物代謝的主要家族[11, 14]。本研究發現在CCl4誘導的NAFL模型中主要CYP酶活性(CYP1A2，CYP2B6(第4周除外)，CYP2C9，CYP2D6，CYP3A4)均有較大程度的降低(P<0.001)。且CCl4模型中溶媒對照組的酶活性隨著大鼠周齡增加而明顯下降，但大鼠還不屬于老齡化大鼠，這有待近一步研究[19]。在高脂飼料誘導的NAFL模型中，主要CYP亞酶活性與空白對照組相比較，無明顯差異。同時，反映肝功能的外周血ALT、AST在兩個模型中有顯著差異：CCl4模型組在3個時間點(第4，6，9周)，和溶媒組比較均顯著增加，而在高脂模型組(第9周)中尚無顯著性變化。由此提示，兩種不同方法建立的NAFL模型，雖然均為以大泡性脂肪變為主的肝臟病變，但是，CCl4通過抑制CYP450亞酶活性，引起肝臟功能受損；而高脂飼料雖引發了肝細胞的脂肪變性，尚未造成顯著的肝臟功能受損。

截至目前，雖有大量NAFL臨床研究數據，以及高脂飼料誘導NAFL的專利和論文，但尚無對CCl4誘導NAFL模型的分析及與高脂模型的比較研究[19-23]。本研究填補了這一空白，結果顯示在不同機制誘導的NAFL病變，CYP酶活性變化模式有明顯不同，提示CYP酶活性變化可用于鑒別CCl4等化學性肝損傷誘導的NAFL。