桑葉對2型糖尿病大鼠肝臟Toll樣受體及其下游信號元件基因表達的影響

王 敏 馬全濤 李亞琪 柳辰玥 張 馳 邱敏懿 張彩娟 王 停 趙保勝 李紅燕

(1 北京中醫藥大學中藥學院，北京，102488； 2 北京中醫藥大學/北京中醫藥研究院，北京，10029； 3 北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京，100029)

糖尿病是由于遺傳或環境等多種因素引起機體胰島素分泌量相對或絕對減少，導致糖類、脂類及蛋白質類等物質代謝紊亂而產生的慢性疾病。城市化，老齡化以及人民生活節奏的加快使糖尿病發病率呈上升趨勢。最新報告顯示，中國成年人中約有1.14億糖尿病患者，發病率高達10.4%，其中約90%為2型糖尿病(T2DM)，糖尿病已成為嚴重威脅我國人民生命健康的非傳染性疾病之一[1]。

T2DM的發病機制暫無定論，其主要病理特征之一為胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)。IR即胰島素調控葡萄糖代謝的生物學效應降低，機體代償性分泌胰島素以維持血糖穩定，貫穿于T2DM的全過程[2]。肝臟是胰島素作用的主要器官，也是發生IR的重要場所[3]。IR的發生與諸多因素有關，炎性反應是其中之一[4]。炎性反應是人體的重要防御機制，機體遭受侵襲后，激活免疫細胞，產生并釋放腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)，白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)以及C反應蛋白(C-reactive Protein,CRP)等炎性反應遞質進行自我保護。Toll樣受體(Toll-like Receptors,TLRs)是免疫應答中重要的模式識別受體，其與配體結合后，可通過髓樣分化因子(Myeloid Differentiation Factor 88,MyD88)依賴性信號途徑或MyD88非依賴性信號途徑轉導，激活核因子-B，誘導分泌炎性反應遞質[5]，干擾胰島素信號的傳遞，導致或加重IR[6]。

桑葉為桑科植物桑(MorusalbaL.)的葉，味苦、甘，性寒，歸肺、肝經，有疏風散熱、清肺潤燥、清肝明目之效，為臨床常用中藥，其用于糖尿病的治療最早載于《本草綱目》，言曰:“桑葉……明目長發，止消渴”。中醫“消渴證”與現代醫學糖尿病特征相似[7]。臨床研究表明，桑葉及其配方治療T2DM藥效顯著[8-9]，對T2DM并發癥亦有一定的防治作用[10-11]。桑葉體內含有生物堿、黃酮以及多糖[12-13]，可通過抑制葡萄糖吸收[14]，抑制B細胞凋亡[15]，改善PI3K信號轉導等途徑實現降糖作用[16]。同時有報道桑葉可以通過抑制炎性反應遞質的表達而降低血糖[17]，但是桑葉抗炎降糖的作用機制研究鮮有報道。本課題組前期研究發現，桑葉可降低自發性糖尿病模型KKAy小鼠胰腺組織中TLR2和TLR4 mRNA的表達[18]，后續實驗中又發現桑葉可降低T2DM小鼠肝臟組織中TLR7、TLR8、TLR9的表達[19]。因此，本實驗擬在前期實驗的基礎上，進一步探究桑葉對TLRs受體及其下游信號元件表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取雄性Wistar大鼠，SPF級，體重180～200 g，斯貝福(北京)生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0002，飼養于北京中醫藥大學屏障環境動物房，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2016-0038。

1.1.2 藥物 桑葉(經北京中醫藥大學中藥學院中藥鑒定系劉春生教授鑒定為桑科植物桑Morus alba L.的干燥葉)，由北京仟草中藥飲片有限公司提供；二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：AAT8173)。

1.1.3 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma，批號：WXBB6772V)；穩豪ONE TOUCH血糖試紙[強生(上海)醫療器材有限公司，批號：4002886]；無水葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20110104)；生物合成人胰島素注射液[諾和諾德(中國)制藥有限公司，批號：EVG4950]；大鼠ELISA胰島素試劑盒(美國ALPCO，批號：04857)；大鼠ELISA TNF-試劑盒(美國Life Technologies，批號：1818268A)；大鼠ELISA IL-6試劑盒(美國Life Technologies，批號：1780090B)；大鼠ELISA CRP試劑盒(美國Life Technologies，批號：0739103116)；Trizol試劑(美國Invitrogen，批號：15596)；cDNA合成試劑盒(美國Thermo Scientific，批號：00279105)；SYBR Green試劑盒(Applied Biosystems，批號：1508501)；Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo Scientific)；CFX96型實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)；Biofuge Primo型離心機(美國Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠適應性飼養1周后，隨機選取10只為正常組，維持飼料喂養，其余大鼠高脂飼料喂養8周后，禁食14 h，腹腔注射1%STZ檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mmol/L，pH 4.2～4.5，4 ℃)，劑量為20 mg/kg體重，正常對照組僅腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。注射后第7天剪尾采血，測定大鼠空腹血糖，血糖值大于12 mmol/L即視為造模成功。大鼠按空腹血糖值隨機分為模型組、二甲雙胍(0.2 g/kg)組、桑葉高劑量(3 g/kg)組和桑葉低劑量(1 g/kg)組，每組12只。

1.2.2 給藥方法 稱取桑葉5 kg，加10倍質量的去離子水，85 ℃煎煮10 h，加熱回流90 min，過濾，濃縮至相當于生藥量3.75 mg/mL。灌胃給藥,1次/d，連續12周，正常組和模型組給予等量動物飲用水。

1.2.3 檢測指標與方法 1)一般指標檢測：每周測定大鼠體重及24 h內進食量和飲水量各1次，給藥11周各組禁食不禁水12 h后進行空腹葡萄糖耐量實驗(OGTT)，灌胃給藥,1 g/kg葡萄糖溶液，測定0、15、30、60、90、120 min內各組血糖值。給藥第12周禁食不禁水12 h后進行胰島素耐量實驗(ITT)，灌胃給藥，75 U/kg胰島素，測定0、15、30、60、90、120 min各組血糖值。上述實驗結束后，禁食14 h后，腹主動脈取血，低溫離心取血清，根據試劑盒說明書要求測定血清中胰島素、TNF-、IL-6、CRP水平。2)TLR7、TLR8、TLR9、MyD88、TRAF-6、NF-B mRNA的水平測定：大鼠麻醉后取肝臟最大葉，-80 ℃保存。Trizol法提取肝臟組織總RNA，核酸蛋白紫外分光儀檢測RNA濃度及完整性。NCBI數據庫查詢大鼠RNA總序列并設計引物，引物由北京博邁德基因技術有限公司合成。各引物序列如下：

β-actin上游5-CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAG-3，下游5-GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA-3，TLR7上游5-GTGTGCACCAAGAGGCTACA-3，下游5-TGGCCCAGGTAGAGTAGATTC-3，TLR8上游5-CTGTGGAATGCAAATGATGG-3，下游5-TCATTTCTCCCCAAGTCCAG-3，TLR9上游5-TGCAGGAGCTGAACATGAAC-3，下游5-ATTGGACAGGTCCACAAAG C-3，MyD88上游5-GTGGTGGTTGTTCTGACGAT-3，下游5-CGCAGATAGTGATGAACCGTAG-3，TRAF-6上游5-CATTGTGAATTCGCTCTAGTGA-3，下游5-GGACAGCTTTGATCGTGGA-3，核因子-B上游5-GAAGAAGCGAGACCTGGAG-3,下游5-TCCGGAACACAATGGCCAC-3。按照SYBR Green試劑盒要求，使用PCR擴增儀，于20 μL反應體系進行擴增。每個樣本設定2個平行孔，取其均數計算CT值，按照如下Pfaffl公式計算目的基因表達量[20]。

Ratio=(Etarget)△CT,target(calibrator-test)/(Eref)△CT ref(calibrator-test)

△CTtarget(calibrator-test)=(CTtarget)A549-(CTtarget)A549PTX

△CTref(calibrator-test)=(CTref)A549-(CTref)A549PTX

其中Etarget、Eref分別為目的基因和內參基因的擴增效率。

2 結果

2.1 5組T2DM大鼠體重及飲水進食比較 實驗中，部分大鼠在實驗后期出現了低血糖死亡，所以最終統計的動物數量出現了差異。由于桑葉起效較慢，前期大鼠各項指標變化不明顯，因此僅列出第12周的數據。與正常對照組比較，模型組體重明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，血糖值、飲水量和進食量均顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組血糖和進食、飲水量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，但體重變化不明顯；桑葉組血糖和飲水量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，但體重和進食量變化不明顯。見表1。

2.2 5組T2DM大鼠糖耐量和胰島素耐量比較 第11周，與正常對照組比較，模型組出現明顯的糖耐量異常，差異有統計學意義(P<0.05)，曲線下面積高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組糖耐量改善明顯，曲線下面積縮小明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，桑葉高劑量組90 min和120 min時血糖值明顯降低，曲線下面積出現明顯差異，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 5組T2DM大鼠血清胰島素含量及胰島素耐量比較 注射胰島素后，與正常組對照比較，模型組為明顯的胰島素耐量異常，差異有統計學意義(P<0.05)，AUC明顯高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)，其空腹胰島素含量明顯升高，胰島素抵抗指數顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和桑葉高劑量組AUC顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，血清胰島素含量明顯下降，胰島素抵抗指數(HOMA-IR)顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、4。

表1 5組T2DM大鼠體重及飲水進食比較

注：與正常對照組比較,*P<0.05；與模型組比較,*P<0.05

表2 5組T2DM大鼠糖耐量和胰島素耐量比較

注：與正常對照組比較,*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

表3 5組T2DM大鼠ITT比較(第11周)

注：與正常對照組比較,*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

表4 5組T2DM大鼠胰島素水平比較

注：與正常對照組比較,*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

2.4 5組T2DM大鼠血清炎性反應遞質比較 與正常對照組比較，模型組血清中IL-6、TNF-和CRP水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)：與模型組比較，二甲雙胍可以明顯降低IL-6、TNF-和CRP水平，差異有統計學意義(P<0.05)；桑葉組IL-6和CRP水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，TNF-有一定的降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 5組T2DM大鼠血清炎性反應遞質比較

注：與正常對照組比較,*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

2.5 5組T2DM大鼠肝臟TLRs及其下游信號元件mRNA比較 與正常對照組比較，模型組TLR7、TLR8、TLR9及TRAF-6、MyD88、核因子-B表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍、桑葉高劑量可以明顯降低TLRs受體及其下游信號蛋白的基因表達量，桑葉低劑量可以明顯降低TLRs受體及其下游信號蛋白的基因表達量，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

3 討論

T2DM是以高胰島素血癥和胰島素抵抗為特征的非傳染性疾病。患者多有飲食不節，過食肥膩，好逸惡勞之惡習，中醫學將之列入“消渴”的范疇，中醫認為“消渴癥”的病機為陰虛燥熱或兼有痰濕血瘀證，治療以益氣養陰清熱藥為主，或配伍以化痰祛瘀藥。桑葉味甘性寒，甘以養陰，寒以涼血，兼有清、潤之效，臨床常用于治療陰虛內熱型消渴[21]。本實驗通過觀察桑葉對高脂飼料喂養聯合STZ注射制備T2DM大鼠的治療作用，發現桑葉可以有效降低大鼠空腹血糖值、飲水量，改善T2DM大鼠OGTT和ITT，同時發現桑葉可以降低HOMA-IR，說明桑葉可以改善T2DM大鼠胰島素抵抗。

桑葉可以降低T2DM大鼠血清中IL-6、TNF-、CRP的水平，提示桑葉改善胰島素抵抗，治療T2DM，可能是通過降低炎性反應水平來實現的。研究顯示，相較于未患病者，T2DM患者體內IL-6、TNF-和CRP水平明顯升高，說明T2DM患者體內存在炎性反應[22]。有學者認為，T2DM是機體非特異免疫產生的慢性炎性反應[23]。炎性反應是機體應對外界刺激產生的防御機制，機體受到病毒、抗原等刺激時，免疫細胞被激活，可分泌IL-6、TNF-和CRP來進行自我保護。IL-6主要由脂肪組織分泌，肝臟也是其分泌的重要部位，正常生理狀態下，IL-6有利于肝糖代謝，T2DM患者體內脂肪代謝紊亂，身體長期處于慢性炎性反應浸潤狀態下，長期過量分泌的IL-6可導致胰島B細胞功能損傷，產生IR[24]。TNF-具有多種生物學活性，可以誘導IL-6等多種炎性反應遞質的分泌，在T2DM過程中，可直接作用于胰島B細胞，抑制胰島素分泌或者通過抑制胰島素受體信號和葡萄糖轉運導致或者加重IR[25]。CRP為非特異性免疫的炎性標志物，是預測T2DM發病的危險因子，其在TNF-和IL-6等炎性反應遞質的刺激下由肝臟產生分泌，可以通過抑制胰島素受體酪氨酸激酶加重IR[26]。本實驗中在前期實驗研究基礎上發現桑葉不僅可以降低糖尿病大鼠肝臟組織TLRs的表達，同時還可以下調其下游信號元件TRAF-6、MyD88以及核因子-B的相對表達。

表6 5組T2DM大鼠肝臟TLRs及其下游信號元件mRNA相對表達量

注：與正常對照組比較,*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

TLRs介導的信號通路在炎性反應中具有重要作用，目前在哺乳動物體內共發現13個具有功能的TLRs，其中TLR1～TLR9為人鼠共有。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白，主要分為胞外域、跨膜區和胞內域3部分，胞外域因與白細胞介素-1受體序列高度相似，被稱作Toll/IL-1(TIR)結構域，主要負責介導下游信號轉導[27]。TLRs介導的信號途徑主要為兩類：一類是MyD88依賴性通路：MyD88活化后與IRAKs結合，活化后的IRAKs與TRAF6磷酸化，并與MyD88解離。TRAF6在與Ubc13/Uevl A催化下發生泛素化，泛素化后的TRAF6激活TAK1，引起IKK復合物磷酸化，促使I-B磷酸化，并與核因子-B解離，核因子-B進入細胞核，激活炎性反應基因，誘使其表達。TLR5、TLR 7、TLR 8、TLR9與配體識別后可以直接激活MyD88，TLR2和TLR在與Mal蛋白結合后再識別MyD88[28]。另一類是非MyD88依賴性通路，由TLR3、TLR4、TLR5激活[29]，間接促進核因子-B的表達，刺激炎性反應遞質分泌。本實驗在前期研究基礎上利用實時PCR技術對桑葉干預后糖尿病大鼠肝臟組織進行檢測，其TLR7、TLR 8、TLR9以及其下游信號通路中MyD88、TRAF6、核因子-B mRNA表達，均出現了不同程度的下降，因此，桑葉可能是通過抑制TLRs及其下游信號元件表達，進而抑制炎性反應，發揮降糖作用。