肝郁脾虛證多發性抽動癥大鼠模型的建立及評價

劉曉芳 薛小娜 王素梅 張 雯 衛 利 王道涵 尹英敏

(1 北京中醫藥大學第二附屬醫院東方醫院,北京,100078; 2 北京中醫藥大學第三附屬醫院,北京,100029)

多發性抽動癥(Tourette Syndrome,TS),是一種兒童精神科常見的神經精神障礙性疾病[1]。肢體肌肉、面部肌肉及頸部肌肉或者患兒出現迅速、反復、不規則的抽動,為TS常見的臨床特征。TS往往有沖動、強迫、多動、注意力不集中等各種伴隨癥狀[2]。本病在臨床缺乏比較有效的治療,嚴重影響了患兒的身心健康,目前受到臨床醫生與社會公眾的極大關注[1]。隨著研究的進展,目前迫切需求建立模擬小兒TS的動物模型,進行病因、病理機制、藥物篩選及藥效學等方面的評價研究,為揭示和有效診治TS提供研究工具。隨著中醫對TS的研究逐漸增多,目前模型不能很好反映中醫“辨證論治”思想精髓的缺點愈加突出。因此,本次實驗擬建立TS大鼠模型的同時,建立其中醫證型中的肝郁脾虛證,并對其以評價,以便對中醫治療兒童TS有進一步的深入研究。結合既往文獻及課題組前期實驗,依據中醫病因發病學原理,本課題組以亞氨基二丙腈(IDPN)腹腔注射誘導法后,用飲食失節、慢性束縛以及過度疲勞法建立TS肝郁脾虛證大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 30只3周齡雄性SPF級SD大鼠(于北京維通利華實驗動物技術有限公司購買,許可證編號為:SCXK(京)2012-0001),要求其重量在40～60 g。自由攝食飲水,保持相對的溫度及濕度,注意環境通風(溫度控制在(22±2)℃,濕度控制在50%-70%)。

1.1.2 藥物 0.9%氯化鈉注射液(北京雙鶴藥業股份有限公司，批號:0906201w),10 mL每支;亞氨基二丙晴1瓶(美國Sigma-Aldrich，批號:24859071)。

1.1.3 試劑與儀器 D-木糖酶測試分析試劑盒(南京建成生物科技有限公司,生產批號:A035)；人胃泌素酶聯免疫分析試劑盒(江萊生物科技有限公司,生產批號:2402503)；精密電子天平(美國雙杰兄弟集團有限公司,JJ2000型)；自發活動視頻分析系統(上海吉星軟件科技有限公司,DB018型)；DigBehv動物行為分析系統(SOFTRON,JLBehv-RRTM)；數碼攝錄一體機(HDR SR10E型,SONY)；微量振蕩器(北京拓普分析儀器有限公司,DEM-3)；酶標儀(Thermo Scientific，Multiskan MK3)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將自由分籠喂養的大鼠分成3組,每組10只,分別標注為肝郁脾虛組、空白組和模型組。讓各組大鼠自由飲水及進食失誤,以12 h為白晝黑夜節律。將各組大鼠適應性喂養1周后,參照全身用藥法[3]及前期課題實驗結論[4-7],模型組及中醫證型組大鼠腹腔注射300 mg/(kg·d)的IDPN,空白組則在腹腔內注射同等的氯0.9%化鈉注射液。各組均注射7 d,1次/d。

1.2.2 給藥方法 參考李艷彥等人的方法[8-10],從腹腔注射IDPN之日起,肝郁脾虛組大鼠于每天上午9:00置于束縛盒中限制其活動3 h,下午3:00放于盛有溫水桶內迫其游泳10 min左右。連續3周隔日給大鼠喂食。于造模第21天開始,停止上述造模因素,觀察其行為變化。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 自主活動次數測定 每周對各組大鼠進行1次自主活動觀察,記錄大鼠15 min內的自主活動情況。

1.2.3.2 刻板運動觀察及評分 于造模后第1天、第7天、第14天、第21天、第28天進行刻板運動觀察及評分。評分時間為2 min,評分標準參照前期研究[2]。

1.2.3.3 中醫證型評價 1)外觀變化:觀察各組大鼠活動活躍度、毛色順滑、進食量多少及大便次數的變化。2)重量測定:于實驗第1天開始,每隔7天測定1次大鼠的重量。3)胃泌素及D-木糖酶定量測定:在實驗第28天測定各組大鼠血清的胃泌素及D-木糖酶。在大鼠眼眶球后取1 mL血,加入無菌試管中。室溫靜置2 h后將其離心,冷凍保存。采用D-木糖酶測試分析試劑盒以及人胃泌素酶聯免疫分析試劑盒檢測其含量。4)脾臟與胸腺指數:胃泌素及D-木糖酶定量測定后,對各組大鼠解剖,取其脾臟、胸腺。將各組器官分別稱重后,根據公式計算各組大鼠的胸腺及脾臟指數

2 結果

2.1 行為學測定 從實驗第4天開始,除空白組外,其余組大鼠在受到外界各種刺激后,出現各種特殊行為,如直立、攀爬。實驗第8天,除空白組外,其余組大鼠均出現不同程度的頭部抽動,同時舔、嗅、活動增多等行為,部分大鼠出現旋轉行為。

2.2 自主活動儀檢測 空白組大鼠與其余組大鼠比較,自主活動數明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05)。模型組與中醫證型組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的自主活動

2.3 刻板運動觀察評分 模型組與肝郁脾虛組比較未見明顯差異(P>0.05)。除空白組外,其余各組大鼠第28天與第7天比較,其刻板運動有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠刻板運動評分分)

2.4 中醫證型測定與評價 肝郁脾虛組大鼠造模后開始出現煩躁易怒的狀態。3周后,肝郁脾虛組

表3 各組大鼠體重比較

大鼠逐漸出現活動及飲食減少,情緒低落,體重增加緩慢(P<0.05),大便次數增多,質地較稀的癥狀。見表3。

2.5 胸腺及脾臟指數測定 肝郁脾虛組以及模型組與空白組比較,其胸腺、脾臟指數差異分別有統計學意義(P<0.05)。肝郁脾虛組大鼠與模型組大鼠之間比,各組指數差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠胸腺及脾臟指數比較

2.6 D-木糖濃度測定與胃泌素測定 中醫證型組大鼠與其余各組比較,其D-木糖濃度測定與胃泌素測定差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 胃泌素及D-木糖濃度

3 討論

多年來,本課題組一直致力于小兒TS的臨床與基礎實驗研究。導師王素梅教授認為,小兒TS病機多屬土虛木亢,風痰內擾,臨證時采用扶土抑木法從肝脾論治,取得一定療效。課題組利用“名老中醫臨床診療信息采集系統”及名老中醫經驗智能分析平臺,對王素梅教授于2005年10月至2006年5月之間建立的102例TS病歷,進行信息結構化、數據分析,結果表明:共757次診次中,中醫辨證分型以肝郁脾虛最多見,共334例次,占44.12%[11-13]。課題組通過文獻查閱亦發現,抽動癥患者以肝郁脾虛型為最多見。因此,本課題組認為,建立TS肝郁脾虛證動物模型對本病的中醫辨證論治有著重大意義。

參照文獻及SD大鼠本身的特點,本實驗造模方法基于以下考慮:動物在慢性束縛中,其活動被禁,引起情緒受抑,情志不遂,氣機不暢,導致肝郁;迫其每日游泳活動10 min,使有勞累感;給予飲食的時而增加與時而缺失類似饑飽失調,兩者相加,與中醫的飲食勞倦類似,導致脾胃受損。本次實驗過程中觀察到,肝郁脾虛證的大鼠體重有明顯的減輕,其外觀表證發生明顯的變化。除了出現頭部抽動、旋轉行為外,大鼠由開始的易怒煩躁轉為情緒低落,同時飲食減少,大便由正常轉為稀溏;活動漸少,體重增加緩慢,與中醫臨床中肝郁脾虛證型表現出的癥狀較接近。

脾臟與胸腺的功能,對動物有重要意義。脾臟與胸腺的各種改變,目前認為是中醫脾虛證的病理學依據之一[14-15]。本次實驗中,中醫證型組動物的脾臟與胸腺指數與空白組比較，差異有統計學意義(P<0.05),與模型組大鼠比較，差異無統計學意義,表明模型組與肝郁脾虛組大鼠均有免疫力的下降。

胃泌素在人體及動物的消化系統中有重要作用。目前有相關文獻表明,其水平下降程度與肝郁脾虛證的嚴重程度有一定的相關性[16]。本實驗中統計學有差異性,說明本脾虛證TS模型具有胃蠕動減弱的病理基礎。血清D-木糖含量水平的變化可以較客觀地反映兒童的消化吸收代謝功能,是一個與機體的小腸吸收功能有正相關性的檢測指標。血清D-木糖水平的變化可以客觀地反映人體的消化功能[17-19]。從中醫角度而言,脾失健運,無法運化水谷精微,使機體無法吸收其精華。表現在生物學糖代謝方面,則會出現D木糖數值降低。本次實驗中中醫證型組大鼠與其余各組大鼠比較統計學有差異性,說明其具有腸道吸收功能減弱的表現。

SD大鼠腹腔注射IDPN所誘導的TS模型抽動癥狀穩定,表面效度良好,可維持較長時間[20-22]。結合飲食失節、慢性束縛以及過度疲勞法建立肝郁脾虛證TS大鼠模型,具有兒童TS中醫證型中的肝郁脾虛證的相似癥狀。但根據兒童TS的臨床表現,其生物學特性目前存在一定的差距,且本次實驗尚缺乏對肝郁癥的生物學檢查方法和相關指標,我們將在下一步的深入研究中繼續探索以彌補本次不足。