缺失dbpA導致大腸桿菌DNA復制起始延遲

張樹軍 勿呢爾 狄建軍 張國文 徐雅楠

（1. 內(nèi)蒙古民族大學生命科學學院，通遼 028000；2. 內(nèi)蒙古大學生命科學學院，呼和浩特 010021）

DbpA是依賴ATP的3′-5′RNA解旋酶，分子量為49.188 kD，主要在核糖體50S亞基形成的晚期發(fā)揮作用［1-2］。DbpA有一個DEAD盒，這是依賴RNA的ATP酶/解旋酶的特征［3］。DbpA特異地與23S rRNA的92號發(fā)夾結(jié)合，并表現(xiàn)出依賴RNA的ATP酶（ATPase）活性，水解一分子ATP可以解開8 bp的雙鏈RNA［4］。除了大腸桿菌外，dbpA基因也存在于許多其他細菌中，這表明DbpA可能在某些情況下，比如缺失其他某一個核糖體成熟因子時，對核糖體的組裝至關(guān)重要［5］。研究發(fā)現(xiàn)R331A點突變的DbpA缺失了其ATPase活性后，引起45S（50S核糖體亞基的前體）不完整顆粒的聚集，45S不完整顆粒可以激活野生型DbpA的ATP酶活性來完成50S核糖體的組裝［2］。如果細菌內(nèi)也缺乏野生型DbpA蛋白，那么過度表達R331A點突變的DbpA會導致各種核糖體顆粒的累積，但最終可以轉(zhuǎn)化為有功能的 50S 大亞基［6］。

dbpA作為核糖體成熟因子，促進50S大亞基的組裝，但它對大腸桿菌DNA復制起始過程的影響還沒有報道。本研究通過觀察dbpA缺失突變體（ΔdbpA）的DNA復制式樣、倍增時間、細胞大小等表型變化來探討dbpA基因?qū)Υ竽c桿菌DNA復制起始的影響，并探討其作用機制。

大腸桿菌的細胞周期分為B期、C期和D期，并且也受到精細的調(diào)控。與真核細胞不同的是，大腸桿菌可以在上一次細胞周期還未完成時，開始下一次的細胞周期，使大腸桿菌的DNA在復制完成之前可以啟動新一輪的DNA復制，所以大腸桿菌細胞內(nèi)可以有多條染色體。大腸桿菌的染色體DNA復制起始于復制原點oriC，主要參與蛋白有DnaA、DnaB和DnaC等。DnaA蛋白是復制起始蛋白，特異地與oriC位點結(jié)合，然后DnaC蛋白協(xié)助DnaB蛋白（解旋酶）進入起始位點，逐漸形成復制引發(fā)體（Primosome）并開始復制。由于細胞內(nèi)DnaA蛋白的數(shù)量和濃度與復制起始的發(fā)生率呈正比關(guān)系［7］。因此，我們檢測ΔdbpA細胞內(nèi)總蛋白和DnaA蛋白的量，并與野生型細胞比較，探究作為核糖體成熟因子的DbpA是否通過影響核糖體的組裝或功能狀態(tài)影響細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，改變細胞內(nèi)總蛋白，包括DnaA蛋白的含量，從而影響DNA復制起始的機理。

DbpA也可能通過與DNA復制起始相關(guān)蛋白DnaA、DnaB或DnaC相互作用影響細菌DNA復制起始，因此我們采用溫度敏感實驗來驗證它們之間是否有相互作用。dnaA46、dnaB252和dnaC2都是DNA復制起始缺陷的溫度敏感突變體，它們在30℃時可以生長，但在42℃時無法生長［8-10］。我們分別將dnaA46、dnaB252和dnaC2的等位基因通過P1轉(zhuǎn)導ΔdbpA構(gòu)建雙突變體，通過觀察雙突變體在30℃、37℃和42℃的生長情況，即溫度敏感性的改變，來探討DbpA是否與DnaA、DnaB或DnaC蛋白有相互作用。

細菌的細胞大小受多種因素的影響，如培養(yǎng)基的營養(yǎng)條件、pH和離子濃度，以及細胞內(nèi)部環(huán)境等。我們通過測量ΔdbpA突變體的細胞大小，探討dbpA基因是否影響細菌的細胞大小。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 野生型大腸桿菌BW25113由本實驗室保存。ΔdbpA菌株由Baba提供，它是BW25113的dbpA基因通過同源重組被卡那霉素（kan）基因替換而構(gòu)建［11］。

1.1.2 試劑與儀器 BCA試劑盒購自Pierce公司，Western blotting用的鼠DnaA單克隆一抗和山羊抗鼠IgG-HRP多克隆二抗購自全式金公司，Hoechst33258 DNA染色液購自MedChemExpress公司。蔡司熒光顯微鏡Axio Imager A2購自Carl Zeiss公司，BD LSRFortessa流式細胞儀購自BD公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和條件 細菌的培養(yǎng)基為LB或ABTGcasa（AB基礎培養(yǎng)基添加10 μg/mL維生素B1、0.2% 的葡萄糖、0.5% 的 Casamino Acids）［12］，LB的營養(yǎng)高于ABTGcasa培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37℃。進行細菌選擇時添加終濃度為50 μg/mL的卡那霉素（Kan）和30 μg/mL的氯霉素（Cap）。

1.2 方法

1.2.1 ΔdbpA菌株的鑒定 PCR驗證dbpA基因是否刪除及kan基因是否插入。引物由上海生工生物工程公司合成。dbpA基因的上游和下游引物分別 為 ：5′-GATGACCACGAGAATAGATTGTG-3′；5′-GATACACAACGTTGCCATTTCTG-3′。PCR 模板為野生型BW25113和ΔdbpA菌株，擴增條件為：94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸60 s，30 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。kan基因的上游和下游引物分別為 ：5′-TGCTCGACGTTGTCACTGAAG-3′；5′- CACCATGATATTCGGCAAGCAG-3′。擴增條件為：94℃變性45 s，53℃退火30 s，72℃延伸120 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.2.2 計算細菌的倍增時間 過夜復蘇的細菌按1∶5 000比例接種至LB或ABTGcasa培養(yǎng)基中，檢測和記錄細菌在對數(shù)生長階段從OD600（LB）或OD450（ABTGcasa）為0.05-0.5時的吸光度值。吸光度值先進行Log2計算，以得數(shù)作為橫坐標，間隔時間作為縱坐標繪制線性關(guān)系圖，最后計算出細胞倍增時間。實驗重復3次，計算平均值和標準差。

1.2.3 測量細胞大小 在LB或ABTGcasa培養(yǎng)基中的細菌以指數(shù)形式生長至OD600/450= 0.15時取1 mL菌液，離心收集菌體，先用TE緩沖液洗滌一次，然后用70%的乙醇固定。使用蔡司顯微鏡觀察細胞，測量并記錄100個以上細胞長軸的長度，取平均值并計算標準差。

1.2.4 流式細胞技術(shù)分析 LB或ABTGcasa培養(yǎng)基中對數(shù)生長期的細胞，在OD600或OD450= 0.15取1 mL菌液，加入終濃度為10 μg/mL的先鋒霉素（CPX）和300 μg/mL的利福平（RFP）處理3-5個細胞周期。先鋒霉素可抑制細胞分裂；利福平通過抑制DNA復制起始所需的轉(zhuǎn)錄而阻止新的DNA復制的啟動，但允許已經(jīng)開始的并正在進行的復制完成［13-14］。所以藥物處理后的細胞其染色體數(shù)目為整數(shù)，并代表添加藥物時細胞內(nèi)的復制原點數(shù)目［13］。藥物處理后的細胞固定在70%乙醇中。使用流式細胞儀檢測時，細胞經(jīng)Hoechst33258 DNA染色液染色30 min，然后使用流式細胞儀進行分析。

1.2.5 溫度敏感實驗 溫度敏感突變體dnaA46（Ts）∷tet、dnaB52（Ts）∷tet和dnaC2（Ts）∷tet的等位基因通過P1轉(zhuǎn)導至ΔdbpA突變體構(gòu)建ΔdbpA dnaA46、ΔdbpA dnaB252和ΔdbpA dnaC2共3個雙突變體［15］。涂板并過夜培養(yǎng)后，從ΔdbpA、DnaA46、DnaB252、DnaC2單突變體和構(gòu)建的3個雙突變體瓊脂平板上分別挑取8個單菌落，每個單菌落分別涂布在3個LB瓊脂平板上，3個瓊脂平板分別置于30℃、37℃和42℃的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察并記錄每個突變體的8個單菌落在每種溫度下生長的數(shù)量。

1.2.6 測定單個細胞的總蛋白 ABTGcasa培養(yǎng)基中的細菌生長至OD450= 0.15時，取9 mL菌液，4℃12 000 r/min離心2 min收集菌體，用1 mL TE緩沖液洗滌一次，再用200 μL含有1% SDS和甘油的TE緩沖液重懸，煮沸5 min。使用BCA比色法測定9 mL菌液的總蛋白量［16］。為了檢測某一體積菌液中細胞的數(shù)量，即菌體密度，再取10 μL菌液用培養(yǎng)液稀釋104和105倍，然后涂布在含有相應抗生素的LB瓊脂平板上，在37℃過夜培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。計數(shù)單菌落的數(shù)量，計算菌體密度并計算出9 mL菌液中細菌數(shù)量。使用9 mL菌液中細菌細胞內(nèi)的蛋白量除以9 mL菌液中細菌數(shù)量計算出每個細胞內(nèi)的總蛋白質(zhì)含量。實驗重復3次，計算平均值和標準差。

1.2.7 測定單個細胞的DnaA蛋白 上面提到的細胞提取液還使用Western blot來測定單個細菌內(nèi)DnaA蛋白的含量。先設定每種菌株細胞內(nèi)的總蛋白質(zhì)的量相等，然后根據(jù)計算出的單個細胞內(nèi)的總蛋白質(zhì)含量，計算每種細胞提取液的使用量。樣品使用12.5%的凝膠進行SDS-PAGE后，經(jīng)半干式印跡將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，先后使用鼠DnaA的單克隆抗體（一抗）和山羊抗鼠的IgG-HRP（二抗）與膜孵育，接著進行顯色和顯影，根據(jù)條帶顏色深淺確定DnaA蛋白的量［17］。實驗重復3次，計算平均值和標準差。

2 結(jié)果

2.1 ΔdbpA菌株的鑒定

dbpA基因PCR擴增的電泳結(jié)果（圖1）顯示野生型BW25113菌株在約1 200 bp處出現(xiàn)條帶，與擴增的dbpA基因片段長度（1 181 bp）相仿；而ΔdbpA菌株未擴增出dbpA基因條帶，說明ΔdbpA菌株中的dbpA基因缺失。kan基因PCR擴增的電泳結(jié)果（圖2）顯示ΔdbpA菌株在約350 bp處出現(xiàn)條帶，與擴增的kan基因片段長度（356 bp）相仿；而野生型BW25113菌株未擴增出kan基因條帶，說明kan基因插入ΔdbpA菌株中，并替換了dbpA基因，即Baba提供的ΔdbpA菌株構(gòu)建成功。

2.2 缺失dbpA基因延遲細菌DNA復制起始及減慢生長速度

圖1 PCR鑒定ΔdbpA菌株的dbpA基因是否刪除

圖2 PCR鑒定ΔdbpA菌株的kan基因是否插入

流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果（圖3，表1）顯示，在ABTGcasa培養(yǎng)基中，野生型BW25113細菌有2、4或8個染色體復制原點，細胞數(shù)目所占比例分別為10%、63%和17%，平均復制原點數(shù)目（AO）為4.4，倍增時間（Doubling time，Dt）是33 min。ΔdbpA含有2、4或8個染色體復制原點的細胞比例分別為18%、62%和10%，A.O.減少到4.2，倍增時間延長至35 min。在LB培養(yǎng)基中，野生型細胞有4、8或16個染色體復制原點，細胞所占比例分別為1%、58%和29%，A.O.是9.4，倍增時間是21 min。而ΔdbpA含有4、8或16個染色體復制原點的細胞比例分別為6%、66%和14%，A.O.減少到9.0，倍增時間延長至25 min。表明缺失dbpA基因使細菌DNA復制起始出現(xiàn)輕度延遲，生長速度也輕度減慢，并且培養(yǎng)基的營養(yǎng)越高，減慢也越多。

2.3 缺失dbpA基因?qū)е录毦毎麥p小

為了探討dbpA基因是否影響細胞大小，我們使用顯微鏡測量野生型BW25113、ΔdbpA在ABTGcasa和LB培養(yǎng)基中的細胞大小。在ABTGcasa培養(yǎng)基中，野生型BW25113、ΔdbpA細胞的平均長度分別為2.69 μm和2.62 μm（圖4和表2）；在LB培養(yǎng)基中的平均長度分別為3.87 μm和3.49 μm（圖4和表2），即分別減小3%和10%。上述結(jié)果表明缺失dbpA基因?qū)е率辜毎w積輕度減少，并且培養(yǎng)基的營養(yǎng)越高，減小程度也越大。

圖3 缺失dbpA基因?qū)е录毦鶧NA復制起始發(fā)生輕度延遲

表1 dbpA基因缺失導致細菌的倍增時間輕度延長

圖4 dbpA基因缺失導致細菌體積輕度減小

表2 dbpA基因缺失導致細菌體積輕度減小

2.4 缺失dbpA不改變dnaA46、dnaB252和dnaC2的溫度敏感性

為了研究DbpA蛋白對DNA復制起始的影響是否通過與復制起始相關(guān)蛋白DnaA、DnaB或DnaC相互作用而導致的，我們使用溫度敏感突變體dnaA46（Ts）、dnaB252（Ts） 和dnaC2（Ts） 構(gòu) 建ΔdbpA dnaA46、ΔdbpA dnaB252和ΔdbpA dnaC2共3種雙突變體。我們發(fā)現(xiàn)dnaA46、dnaB252和dnaC2每種溫度敏感突變體的8個單菌落在30℃時都能生長，37℃時絕大多數(shù)能生長，而42℃時都不能生長。ΔdbpA突變體的8個單菌落在30℃、37℃和42℃時都可以生長。3種雙突變體的8個單菌落在30℃時都可以生長，37℃時絕大多數(shù)能生長，但42℃時都不能增長，即雙突變體的dnaA46、dnaB252和dnaC2的溫度敏感性都沒有改變。表明DbpA影響DNA復制起始不是通過與DnaA、DnaB或DnaC蛋白相互作用導致的（表3）。

表3 刪除dbpA基因不改變dnaA46、dnaB252和dnaC2的溫度敏感性

2.5 缺失dbpA基因降低細菌細胞內(nèi)總蛋白和DnaA蛋白的相對含量

DnaA蛋白是DNA復制的起始蛋白，并且細胞內(nèi)DnaA蛋白的數(shù)量與染色體DNA復制的起始發(fā)生頻率呈正相關(guān)。dbpA基因可能通過改變細胞內(nèi)DnaA的數(shù)量影響細菌復制的起始。為了檢測這個可能性，我們比較ΔdbpA和野生型BW25113單個細胞內(nèi)的總蛋白和DnaA蛋白的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與較野生型細胞相比，在ABTGcasa培養(yǎng)基中，ΔdbpA單個細胞內(nèi)的總蛋白和DnaA蛋白含量分別減少了8%和6%、（圖5-A）；而在LB培養(yǎng)基中，分別減少17%和18%（圖5-B）。表明刪除dbpA基因使細胞內(nèi)的總蛋白和DnaA蛋白的量都輕度下降。并且培養(yǎng)基的營養(yǎng)越高，下降程度也越大。

3 討論

圖5 缺失dbpA基因降低ABTGcasa（A）和LB（B）培養(yǎng)基中單個細胞的總蛋白

大腸桿菌核糖體的組裝是非常快速和高效的，且有多種裝配途徑，在2-3 min內(nèi)（37℃）就能完成有功能的50S核糖體大亞基的組裝［18］。大腸桿菌有5種DEAD蛋白，分別是CsdA、DbpA、RhlB、RhlE和SrmB，它們作用的底物都是RNA。DbpA作為依賴ATP的RNA解旋酶，特異地與23S rRNA結(jié)合，參與50S大亞基的裝配，而它特異結(jié)合的23S rRNA的92號發(fā)夾還參與核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心（Peptidyltransferase center，PTC）的構(gòu)成［2］。

對于dbpA是否影響細胞表型，不同的實驗得出的結(jié)果也有很大差別。Iost等和Peil等［19-20］發(fā)現(xiàn)dbpA刪除突變體的生長速度和核糖體輪廓在37℃和低溫20℃或25℃時都沒有變化。可能的原因：（1）突變或刪除導致細菌缺失有功能的DbpA后，可以由其他核糖體成熟因子完成50S亞基組裝所需的RNA異構(gòu)化步驟。（2）在核糖體組裝過程中缺少DbpA的作用，雖然出現(xiàn)了錯誤組裝的中間粒子（45S），并累積到某一程度時，細菌通過其他機制糾正錯誤組裝而形成有功能的50S大亞基。

Elles等［21］發(fā)現(xiàn)dbpA在R331A的定點突變導致其解旋酶活性和ATP酶活性降低；細菌還表現(xiàn)出明顯的生長緩慢和冷敏感的表型。她們分別將含有野生型、K53A和R331A點突變dbpA基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入TunerTM（DE3）pLacI RecA-菌株后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入K53A和R331A點突變dbpA重組質(zhì)粒的菌株生長速度在37℃時比野生型慢；在22℃低溫時，它們的倍增時間分別為113 min、134 min和251 min；即R331A點突變的倍增時間在37℃是野生型的1.6倍，在22℃時是2.2倍，并且還發(fā)現(xiàn)細菌從生長緩慢期到對數(shù)生長期的用時也較長。說明dbpA突變使細菌在37℃和低溫22℃時的生長速度都減慢。可能原因：（1）DpbA作為核糖體成熟因子參與50S大亞基的裝配和成熟，缺失DpbA的功能導致45S顆粒聚集，50S核糖體無法形成或形成速度減慢，細胞內(nèi)有功能的核糖體數(shù)量減少，降低翻譯效率。（2）缺失DpbA的功能導致細胞內(nèi)形成錯誤組裝的、無功能的核糖體，降低翻譯活性。（3）DbpA不僅與50S核糖體亞基組裝有關(guān)，還與翻譯活性有關(guān)，因為與它結(jié)合的23S核糖體的92號發(fā)夾還參與肽基轉(zhuǎn)移酶中心（PTC）的組成，并且成熟核糖體的92號發(fā)夾被埋藏在PTC內(nèi)。缺失DpbA的功能可能影響PTC的形成，進而影響翻譯過程的進行。

本實驗結(jié)果與Elles等［21］的結(jié)果相同，即與野生型BW25113比較，ΔdhpA的倍增時間在ABTGcasa培養(yǎng)基中增加6%，在LB培養(yǎng)基中增加19%左右。表明dbpA缺失的突變體在兩種培養(yǎng)基中的生長速度均減慢，且培養(yǎng)基營養(yǎng)越高，生長速度減慢越多。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是培養(yǎng)基的營養(yǎng)越高，細菌生長速度越快，蛋白質(zhì)的合成速度也越快，需要的核糖體也越多。但dbpA的缺失導致核糖體無法組裝、組裝速度慢及組裝的核糖體無功能等原因，使細胞內(nèi)有功能的核糖體數(shù)量下降，翻譯活性降低，導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成減少。此外，缺失dpbA還可能影響PTC的形成，影響翻譯過程，并導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成減少。以上因素引起細胞內(nèi)總蛋白量降低，包括DnaA蛋白，并導致細菌代謝、生長和繁殖速度減慢，出現(xiàn)DNA復制起始延遲、倍增時間延長、細胞體積減小等表型變化。

4 結(jié)論

dbpA影響大腸桿菌染色體復制的起始，缺失dbpA導致細菌出現(xiàn)DNA復制的延遲啟動，生長速度的減慢及細胞體積的減小等變化，并且培養(yǎng)基的營養(yǎng)越高，變化程度也越大。主要原因可能是dbpA的缺失導致核糖體組裝缺陷及無法形成，降低了細菌蛋白質(zhì)的合成，包括DnaA蛋白，出現(xiàn)DNA復制延遲等表型變化。