菌株Serratia sp.PW7不同定殖方式對黑麥草中芘污染去除及其內(nèi)生菌群的影響

李 爽，左尚武，王萬清，王金嵩，權成偉，朱雪竹*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京 210095；2.北京科技大學天津?qū)W院，天津 301830）

多環(huán)芳烴（PAHs）是一類環(huán)境中廣泛存在的持久性有機污染物，具有致癌性、致畸性和致突變性，因其具有強疏水性和較高的辛醇-水分配系數(shù)，易于被植物吸收積累并通過食物鏈富集，嚴重威脅生態(tài)系統(tǒng)和人體健康[1-3]。2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，我國耕地土壤中多環(huán)芳烴污染點位超標率高達1.4%，重度污染占到了0.2%[4]。在南京工業(yè)污染場地表層土壤中的PAHs平均濃度達到了17.64 mg·kg-1[5]。PAHs污染形勢嚴峻，因此如何利用有效手段規(guī)避環(huán)境和污染區(qū)作物PAHs污染風險應是目前的研究重點。

植物-微生物聯(lián)合修復汲取了植物和微生物修復的優(yōu)勢，近來受到廣泛關注[6-8]。植物中存在數(shù)量龐大、種類豐富多樣的內(nèi)生細菌，植物與內(nèi)生細菌、內(nèi)生細菌之間的互利共生關系保證了內(nèi)生細菌能夠長期穩(wěn)定的定殖在植物體內(nèi)[9]。植物為內(nèi)生菌提供場所、營養(yǎng)和防護[8]，內(nèi)生菌相比根際細菌具有更強抵御生物和非生物脅迫的能力[10]。Siciliano等[11]研究表明，在污染地區(qū)的具有難降解物降解能力的細菌中內(nèi)生細菌占比高于根際細菌，暗示在這些難降解物的代謝中內(nèi)生細菌發(fā)揮主要作用。另外，一些內(nèi)生細菌可以通過自身分泌乙烯和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸鹽（ACC）脫氨酶等物質(zhì)促進植物生長[12]，代謝有機污染物，增強植物抗逆性，提高產(chǎn)量[13]。研究表明一些植物內(nèi)生細菌具有降解植物體內(nèi)有機污染物的能力，常見降解菌有 Pantoea 屬[14]、Pseudomona 屬[15]、Sphingo?bacterium屬[16]等。黑麥草、紫花苜蓿等牧草常作為修復植物，其吸收積累的PAHs會隨食物鏈進入牲畜和野生動物體內(nèi)，危害食品和生態(tài)安全，因此如何在高效修復的同時降低植物體內(nèi)PAHs污染是亟待解決的問題。將功能菌定殖到植物體內(nèi)，有助于降低植物污染風險，提高修復效果。Sun等[17]將從看麥娘中分離篩選出的芘降解內(nèi)生細菌Staphylococcus sp.BJO6定殖到黑麥草體內(nèi)能夠促進植株生長并有效降低植株芘積累量。由此可見，利用功能內(nèi)生菌定殖植物是規(guī)避植物PAHs等有機物污染的有效途徑。內(nèi)生菌群在植物代謝體內(nèi)PAHs等有機污染物的過程中起重要作用。菌群組成和結(jié)構影響其對有機污染物的降解能力。Vila等[18]研究海洋重油降解菌群的菌群結(jié)構時發(fā)現(xiàn)，在能夠高效降解3～5環(huán)PAHs的海洋細菌群落中，Alphaproteobacteria細菌與低環(huán)PAHs的降解相關，而Gammaproteobacteria細菌則與高環(huán)PAHs的降解相關。彭安萍等[19]提出可以利用植物中功能內(nèi)生細菌調(diào)控PAHs的吸收和代謝，這對于保障污染區(qū)作物安全和修復污染區(qū)土壤具有重要意義。研究功能菌定殖對PAHs污染植物體內(nèi)可培養(yǎng)細菌種群的影響，有助于了解功能菌與內(nèi)生細菌和植物的作用關系，篩選出更多具有高效降解能力的功能內(nèi)生細菌。

芘為四環(huán)多環(huán)芳烴的典型代表，常用作PAHs污染測定的指示物和生物降解研究的模型分子[20]。黑麥草是一種常見的牧草，具有生長迅速、根系發(fā)達的特點，能耐受高濃度的PAHs污染，常用于有機污染的植物修復[21]。本研究以芘作污染物，黑麥草為供試植物，采用水培體系研究了芘降解功能內(nèi)生細菌Ser?ratia sp.PW7定殖（浸根和浸種）對黑麥草體內(nèi)芘污染去除以及可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的影響，并進一步探究功能內(nèi)生細菌定殖對有機污染物代謝的影響機制，為功能內(nèi)生菌-植物體系修復PAHs污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 功能菌株、宿主植物及芘

供試菌株為本實驗室分離的一株植物功能內(nèi)生細菌PW7（Serratia sp.），16S rRNA基因在GenBank登錄號為MG922497，具有高效芘降解能力，對鏈霉素、壯觀霉素及四環(huán)素具有良好抗性[22]。

供試植物為黑麥草（Lolium multiflorum L.），購自明達種子公司。

本研究所用芘，分子式為C16H10，純度大于98%，純水中溶解度為0.12 mg·L-1，辛醇-水分配系數(shù)（lg Kow）為5.18，購自德國Fluka公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

植物水培體系采用Hoagland營養(yǎng)液[23]，植物中總可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基[23]，功能內(nèi)生細菌培養(yǎng)采用含芘及兩種抗生素的基礎鹽培養(yǎng)基[24]。

1.2 實驗方法

1.2.1 功能菌株定殖及水培實驗

本實驗設置浸根定殖（LR）、浸種定殖（LS）和未接菌對照組（LK），各接種處理黑麥草分別暴露于含0、0.1、0.5 mg·L-1芘的Hoagland培養(yǎng)液中。實驗共設置9組處理，每個處理設置3個重復。

接種菌株PW7菌懸液制備：單菌落接種LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 150 r·min-1搖床培養(yǎng) 24 h，8000 r·min-1離心5 min收集菌體，用液體基礎鹽培養(yǎng)基清洗2遍后調(diào)整菌懸液OD600nm值至1.0，4℃?zhèn)溆谩：邴湶萁臃N方法如下：（1）浸根定殖：黑麥草種子經(jīng)過表面消毒，催苗育種48 h后，在Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)至株高約10 cm左右，菌懸液浸泡黑麥草根部6 h，無菌水沖洗后備用。（2）浸種定殖：經(jīng)過表面消毒的黑麥草種子，催苗育種48 h后，菌懸液浸泡6 h，無菌水沖洗后，在Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)至株高約10 cm左右備用。接種處理后的幼苗移苗至裝有250 mL不同芘濃度Hoagland培養(yǎng)液的棕色廣口瓶中，每瓶10株，置于晝夜溫度25℃/20℃的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d后采集植物樣品進行芘含量和內(nèi)生菌群測定。

1.2.2 植物體內(nèi)定殖菌和內(nèi)生細菌計數(shù)及分離純化

采用菌落計數(shù)的方法表征功能菌在植物體內(nèi)的定殖效率：清洗后的新鮮植物莖葉和根部依次經(jīng)過75%的乙醇浸泡3 min、無菌水沖洗3～4次、2%的次氯酸鈉溶液漂洗3 min，無菌水沖洗5次后置于固體LB平板上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，若無菌落產(chǎn)生，表明表面滅菌成功。經(jīng)表面滅菌處理的植物樣品，研磨成勻漿后進行梯度稀釋，涂布于基礎鹽抗性平板（芘終濃度 50 mg·L-1、鏈霉素終濃度 100 mg·L-1、壯觀霉素終濃度100 mg·L-1），30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，設3個重復，結(jié)合菌落形態(tài)觀察和16S rRNA基因測序驗證進行平板計數(shù)，計算出每克鮮組織含菌量（lg CFU·g-1）

可培養(yǎng)內(nèi)生細菌計數(shù)及分離純化：植物樣品經(jīng)表面滅菌處理后研磨成勻漿并進行梯度稀釋，涂布于LB固體平板，30℃恒溫培養(yǎng)72 h，每個處理設3個重復。長出菌落后，對各菌落進行菌落形態(tài)觀察并計數(shù)，找出優(yōu)勢菌落。然后采用劃線分離方法，對不同菌落進行進一步分離、純化。最后將純化的菌落劃線于LB固體平板上，培養(yǎng)后于4℃短期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 植物內(nèi)生細菌鑒定及對芘的降解能力驗證

利用菌落形態(tài)觀察和16S rRNA基因序列同源性分析鑒定分離得到的植物內(nèi)生細菌菌株，并確定其分類地位。提取各內(nèi)生細菌總DNA（細菌基因組DNA提取試劑盒，TIANGEN）為模板進行16S rRNA基因的PCR擴增。采用引物為27f（5′-AGAGTTTGATCATG?GCTCAG-3′）和 1492r（5′-GGTTACCTTGTTAC?GACTT-3′）。PCR擴增體系：正反向引物各0.5 μL、Premix Taq（TaKaRa）12.5 μL、模板DNA 1 μL，無菌水定容至25 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR擴增產(chǎn)物送金斯瑞生物科技有限公司測序。在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進行16S rRNA基因序列同源性比對分析，同時提交各內(nèi)生細菌測序序列至GenBank并獲得登錄號。各可培養(yǎng)內(nèi)生菌按5%接種量測試其在以芘為唯一碳源的基礎鹽培養(yǎng)基中15 d對20 mg·L-1芘的降解能力。

1.2.4 植物內(nèi)生細菌多樣性分析

植物可培養(yǎng)內(nèi)生細菌群落多樣性分析采用Shan?non-Wiener多樣性指數(shù)（H）和均勻性指數(shù)（J），其計算公式如下：

H=∑piln pi

J=H/ln S

式中：pi為某處理組中各內(nèi)生細菌數(shù)量占比；S為某處理組內(nèi)生細菌群落所有種屬數(shù)。

1.2.5 芘測定

植物樣品芘提取方法參照文獻[25]。具體操作：植物根和莖葉冷凍干燥后，稱量干質(zhì)量（生物量）；經(jīng)研磨粉粹均勻后稱取一定量植物樣品于玻璃離心管中，每次10 mL加入二氯甲烷和正己烷等體積混合溶液超聲萃取30 min，重復3次；萃取液經(jīng)無水硫酸鈉柱-硅膠柱凈化，用10 mL二氯甲烷和正己烷等體積混合液洗脫后收集至圓底燒瓶；40℃恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，甲醇定容至5 mL，過0.22 μm孔徑濾膜后，采用高效液相色譜（HPLC）定量分析。培養(yǎng)液中芘提取：取10 mL Hoagland培養(yǎng)液于玻璃離心管中，加等體積甲醇，超聲萃取30 min，過0.22 μm孔徑濾膜后，HPLC定量分析。HPLC分析參數(shù)：烷基C18反相色譜柱（4.6 mm×150 mm），流動相甲醇∶水（V∶V）=90∶10，流速1.000 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制，SPSS 19.0軟件進行單因素（ANOVA）方差分析和雙因素相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生物量及樣品中芘含量

菌株PW7定殖促進了黑麥草幼苗的生長，提高了植株生物量（表1）。在高濃度污染情況下，定殖對植株的促生作用更顯著。定殖的促生作用在莖葉的生長上更加明顯，定殖后莖葉生物量增加7.7%～28.0%，根生物量增加5.3%～27.6%。比較2種定殖方法，浸根定殖的促進作用大于浸種。與對照相比，浸根處理后低濃度 0.1 mg·L-1和高濃度 0.5 mg·L-1芘污染組植株根生物量顯著提高了18.5%和27.6%。本研究表明菌株PW7定殖能夠顯著降低黑麥草體內(nèi)和水培液中的芘污染。在高濃度芘污染水平下，相比未接菌對照組，浸根接種和浸種接種使植株根中芘濃度顯著降低了44.2%和19.9%，使植株莖葉中芘濃度顯著降低了42.3%和22.2%。浸根接種更高效地去除了植物體內(nèi)的芘。此外，相比未接菌對照，在低濃度芘污染組，培養(yǎng)液中芘去除率經(jīng)浸種和浸根定殖后分別顯著提高了29個和38個百分點，在高濃度芘污染組，浸根定殖后培養(yǎng)液中芘去除率顯著提高了18個百分點。這些結(jié)果表明，功能菌株PW7定殖能夠有效去除植物體內(nèi)和環(huán)境中的芘污染，其中浸根與浸種定殖雖效果不同，但均為有效的修復方法。

2.2 植物體內(nèi)定殖的PW7數(shù)量

菌株PW7在黑麥草體內(nèi)的數(shù)量代表了其在黑麥草體內(nèi)的定殖效率。圖1表明，黑麥草莖葉和根中定殖菌數(shù)量為3.49～7.63 lg CFU·g-1，表明大量的菌株PW7能夠成功定殖在植株體內(nèi)生存繁殖。相同處理組，植株根中定殖菌數(shù)量均為莖葉中的100倍以上，表明菌株主要定殖在根中，但可以移動到莖葉部。同一芘污染水平下，浸根組根和莖葉中的定殖菌數(shù)量均比浸種組大一個數(shù)量級，表明與浸種定殖相比浸根定殖菌株PW7在植株體內(nèi)的定殖效率更高、效果更好。此外，隨著芘濃度的提高，植株根和莖葉中定殖菌數(shù)量均有增加的趨勢，其中浸種組植物莖葉中的定殖菌數(shù)量變化顯著，表明一定濃度芘污染有利于菌株PW7的生存繁殖。

圖1 黑麥草根和莖葉中菌株PW7定殖數(shù)量Figure 1 Cell counts of strain PW7 in the roots and shoots of inoculated ryegrass

表1 菌株PW7定殖對黑麥草生長以及芘殘留的影響Table 1 Effects of inoculation with strain PW7 on the plant growth，pyrene removal in the plant and Hoagland solutions

2.3 植物可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量

芘污染和功能菌株定殖能夠影響黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的數(shù)量。由圖2可知，未接菌組中，與無芘污染相比，芘污染使植株根中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量顯著下降，而莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量顯著提高，但高濃度芘處理植株莖葉中內(nèi)生細菌數(shù)量相比低濃度芘處理顯著下降。在相同芘污染水平下，菌株PW7定殖改變了植株中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量。其中無污染和低濃度芘污染水平下，功能菌定殖降低了根中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量，提高了莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量；高濃度芘污染水平下，定殖使植株根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量均有所提高。與未接菌對照組相比，浸根對黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量的影響更顯著，這可能是菌株PW7定殖提高植物體內(nèi)和環(huán)境中芘去除率的原因。

2.4 植物內(nèi)生細菌分離、鑒定及分類分析

圖2 不同芘污染及定殖處理對黑麥草中總內(nèi)生細菌數(shù)量的影響Figure 2 Effects of pyrene contamination and strain PW7 inoculation on the cell counts of cultivable endophytic bacteria in ryegrass

圖3 LB培養(yǎng)基上32株內(nèi)生細菌照片F(xiàn)igure 3 Photographs of colonies of the 32 endophytic bacterial strains on LB medium plate

表2 不同處理組黑麥草中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌分類匯總Table 2 Cultivable endophytic bacterial strains isolated from the ryegrass

本研究從不同芘污染和定殖處理組的黑麥草植株體內(nèi)共分離出32株可培養(yǎng)內(nèi)生細菌，各內(nèi)生細菌菌落形態(tài)如圖3所示，表明植物內(nèi)生細菌具有豐富的多樣性。從表2可以看出，根據(jù)16S rRNA基因序列同源性比對分析，黑麥草體內(nèi)的32株內(nèi)生細菌分別屬于 Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Beta?proteobacteria、Actinobacteria、Bacilli和Flavobacteria 6個綱，其中Gammaproteobacteria和Actinobacteria為根中優(yōu)勢綱，而Actinobacteria和Flavobacteria為莖葉中優(yōu)勢綱。從屬分類水平上看，這32株可培養(yǎng)內(nèi)生細菌分屬21個屬，其中Microbacterium屬的細菌種類最多，Pseudomonas屬、Paenibacillus屬次之。32株內(nèi)生細菌中，6株根部特有（PYRL9、PYRL10、PYRL12、PYRL19、PYRL23、PYRL25）、3 株 莖 葉 部 特 有（PYRL2、PYRL29、PYRL32）、4株芘污染植株特有（PYRL9、PYRL10、PYRL12、PYRL13）、4株接菌植株特有（PYRL9、PYRL22、PYRL23、PYRL25）。此外，在芘污染條件下，菌株PW7定殖黑麥草增加了黑麥草體內(nèi)的可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的種類，菌株PW7浸根接種的黑麥草根部內(nèi)生細菌種數(shù)最多，低濃度和高濃度芘污染水平下分別為17種和16種。

2.5 植物可培養(yǎng)內(nèi)生細菌種群特性

采用香農(nóng)-威爾指數(shù)（H）和均勻性指數(shù)（J）兩個生物多樣性指數(shù)來表征黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的種群多樣性。如表3所示，未接菌組中，與無污染相比，除低濃度芘處理組根中內(nèi)生細菌種群的香農(nóng)-威爾指數(shù)和均勻性指數(shù)升高外，其他組均有所降低，表明除低濃度芘污染能略微提高黑麥草內(nèi)生細菌種群多樣性和均勻度外，芘污染會降低可培養(yǎng)內(nèi)生細菌種群的多樣性和均勻度，污染水平越高，影響越明顯。在相同濃度芘污染條件下，菌株PW7浸根和浸種定殖均能夠提高芘污染黑麥草根和莖中內(nèi)生細菌種群的香農(nóng)-威爾指數(shù)，只是提高程度存在差異，均勻性指數(shù)與香農(nóng)-威爾指數(shù)存在類似規(guī)律。表明功能菌定殖能夠提高黑麥草內(nèi)生細菌種群多樣性和均勻度，降低芘污染對黑麥草內(nèi)生細菌種群多樣性的影響。

表3 黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌種群分析Table 3 Populations of endophytic bacteria in ryegrass seedlings

芘污染和菌株PW7定殖還會影響黑麥草根和莖葉可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的優(yōu)勢種屬，影響內(nèi)生細菌的群落結(jié)構。從表3可知，未接菌組中，芘污染黑麥草根中優(yōu)勢種屬由Micrococcus屬和Rhizobium屬變?yōu)镻an?toea屬，芘污染黑麥草莖葉中絕對優(yōu)勢種屬由Curto?bacterium屬變?yōu)镸icrobacterium屬。相同芘污染水平下，菌株PW7接種后，黑麥草根部Serratia屬成為絕對優(yōu)勢種屬（LR0.5中為略優(yōu)勢種屬），黑麥草莖葉部優(yōu)勢種屬中的Chryseobacterium屬變?yōu)镻antoea屬（LS0.1、LR0.1）、Pseudomona屬（LS0.5）和Sphingobacte?rium屬（LR0.5）。

對比表3中不同處理組黑麥草根和莖葉部優(yōu)勢菌株的芘降解效能發(fā)現(xiàn)，黑麥草內(nèi)優(yōu)勢菌株均對芘具有一定的降解能力，其中菌株PYRL3（Erwinia）、PYRL11（Serratia）、PYRL14（Rhizobium）、PYRL15（Sphin?gobacterium）、PYRL18（Curtobacterium）、PYRL19（Kocu?ria）、PYRL24（Micrococcus）對20 mg·L-1芘的15 d降解率超過55%。在芘污染條件下，定殖黑麥草內(nèi)優(yōu)勢菌株芘降解能力普遍高于未接菌黑麥草內(nèi)優(yōu)勢菌株，表明菌株PW7定殖能夠通過改變黑麥草內(nèi)群落組成提高植物中芘去除能力。此外，各處理組根部優(yōu)勢菌株芘降解能力普遍高于莖葉中優(yōu)勢菌，表明根是黑麥草生物降解芘的主要部位。

3 討論

功能內(nèi)生細菌在植物體內(nèi)的定殖效率是其發(fā)揮生物防治作用的關鍵因素[26]。本研究中接菌處理后定殖在黑麥草根和莖葉部的定殖菌株PW7數(shù)量達103～107CFU·g-1，表明菌株PW7能夠成功定殖在黑麥草組織中并能良好生存和繁殖。菌株PW7的高效定殖有利于降低植物芘污染和促進植物生長。相關性分析表明：在芘污染條件下，黑麥草體內(nèi)功能菌定殖數(shù)量與植株生長增量顯著正相關（根中ρ=0.647，P=0.031；莖葉中ρ=0.661，P=0.038）；特別是芘污染下黑麥草體內(nèi)功能菌定殖數(shù)量與植株中芘污染去除也顯著正相關（根中ρ=0.879，P=0.01；莖葉中ρ=0.655，P=0.029）。研究表明，內(nèi)生細菌的定殖效率受很多因素影響，除植物自身因素[27]、內(nèi)生細菌基因組[28]等因素外，定殖方式也會影響功能內(nèi)生細菌的定殖效率。Afzal等[6]采用4種定殖方式將內(nèi)生細菌Burkholderia phytofirmans PsJN接種到柴油污染地區(qū)的黑麥草體內(nèi)，結(jié)果表明，PsJN菌株灌根接種的定殖效率最高，表現(xiàn)出最佳的生防效果。本研究結(jié)果也證實相比浸種接種，浸根接種黑麥草的菌株PW7定殖效率更高，降低芘污染風險的效果更好。

隨著芘污染濃度的增大，黑麥草根中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量顯著減少，莖葉中的數(shù)量在低濃度增加，在高濃度減少，且變化顯著。Liu等[29]的研究結(jié)果也表明隨著菲污染濃度的升高，小麥根中內(nèi)生細菌總數(shù)減少，莖葉中先增后減。說明低濃度PAHs污染能促進植物莖葉中內(nèi)生細菌生長，高濃度表現(xiàn)出抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)菌株PW7定殖提高了高濃度芘污染下黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量，而且可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量與功能菌定殖效率有關，相關性分析表明根中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量與功能菌定殖效率呈正相關關系（ρ=0.681，P=0.015），且根中內(nèi)生細菌數(shù)量增加與植物體內(nèi)芘污染去除顯著正相關（ρ=0.668，P=0.035）。這些結(jié)果說明，菌株PW7也可通過提高植物體內(nèi)總可培養(yǎng)內(nèi)生細菌數(shù)量降低植物體內(nèi)芘污染。

本研究分別從黑麥草體內(nèi)分離出21屬共32株可培養(yǎng)內(nèi)生細菌，分別屬于Gammaproteobacteria、Alpha?proteobacteria、Betaproteobacteria、Actinobacteria、Ba?cilli和Flavobacteria 6個綱，表現(xiàn)出植物內(nèi)生菌群豐富的多樣性。豐富多樣的內(nèi)生細菌有利于促進植物生長、提高抗逆性。高濃度PAHs污染能夠降低微生物多樣性，Wang等[30]研究表明在高濃度PAHs污染下沉積物中細菌多樣性顯著下降，而Cravo-Laureau等[31]認為菌群多樣性降低會嚴重影響污染物的降解。通過多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，高濃度芘污染能夠降低植物內(nèi)生細菌的多樣性和均勻度，但菌株PW7浸根和浸種定殖均能有效提高黑麥草根和莖葉中內(nèi)生細菌的多樣性和均勻度，緩解了芘污染對植物內(nèi)生細菌多樣性的破壞作用。這結(jié)果與Afzal等[6]的研究一致，表明利用植物與內(nèi)生細菌聯(lián)合作用是修復有機物污染的有效方法。

盛月慧等[23]將5種濃度菲作用于黑麥草后發(fā)現(xiàn)，根、莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌種群發(fā)生了不同程度的改變，植物內(nèi)生細菌能對有機物污染做出響應。而菌株PW7定殖能使芘污染黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌群落組成產(chǎn)生明顯變化，改變植物優(yōu)勢種屬，增強對有機污染物的代謝能力。芘降解菌株PW7定殖后其所屬的Serratia屬成為黑麥草根中的絕對優(yōu)勢屬，其他優(yōu)勢屬Pantoea屬、Micrococcus屬和Erwinia屬也表現(xiàn)出較高的芘降解潛能。宋立超等[14]用菌株Pantoea sp.TJB5胞內(nèi)酶對50 mg·L-1菲處理12 h的降解率達到70.1%。Nida等[32]將Micrococcus屬細菌制成菌蠟球用于石油烴降解。定殖處理后芘污染黑麥草莖葉中的優(yōu)勢屬Microbacterium屬[33]、Pantoea屬、Pseudomona屬[15]和Sphingobacterium屬[16]也均被報道過具有芳香烴降解潛能。Phillips等[15]研究紫花苜蓿內(nèi)生細菌群落與芳香烴污染降解能力的關系時發(fā)現(xiàn)，當Pseudomonas屬存在時，植物烷烴代謝能力提高，而當Pseudomonas屬和Brevundimonas屬共同存在時，植物芳香烴的代謝能力提高。功能菌定殖后這些具有芘降解潛能的屬成為植物中的優(yōu)勢屬，提高了植物代謝芘的能力，降低了植物和環(huán)境中芘的污染風險。此外，浸根和浸種處理黑麥草內(nèi)生細菌群落組成的差異可能是兩種定殖方式的定殖效率不同造成的。

綜上所述，明確功能內(nèi)生細菌定殖對植物生長量、體內(nèi)芘含量及內(nèi)生細菌群落的影響，有助于利用內(nèi)生細菌調(diào)控植物對PAHs的吸收和代謝，篩選更多具有高效降解潛能的內(nèi)生細菌，完善有機污染物的植物-微生物聯(lián)合修復方法，進而有效規(guī)避有機物污染區(qū)作物的污染風險。然而，功能內(nèi)生細菌定殖對植物內(nèi)生細菌種群的影響機制和定殖方式的影響機制還有待進一步研究。

4 結(jié)論

（1）芘降解內(nèi)生細菌PW7能高效定殖在黑麥草根和莖葉中，促進植物生長，提高芘污染黑麥草根和莖葉中內(nèi)生細菌數(shù)量和多樣性，改變黑麥草內(nèi)生細菌群落組成，進一步提高了植物中芘的代謝能力，顯著降低了植物芘污染。

（2）浸根與浸種兩種定殖方式均為有效可行的定殖修復方式，相比浸種定殖，具有更高定殖效率的浸根定殖表現(xiàn)出更顯著的促生作用、菌群改變和減芘效果。關于定殖方式對內(nèi)生菌群及芘污染去除的影響機制還有待進一步研究。

（3）功能菌浸根和浸種定殖是高效的有機物環(huán)境污染植物-微生物聯(lián)合修復方法，能有效規(guī)避污染區(qū)作物污染風險，為更多功能菌株的發(fā)現(xiàn)和微生物菌種在污染修復中的應用提供依據(jù)和參考。