不同直徑化橘紅果實中柚皮苷含量的比較

李瓊霞 黎曉欣 謝承恩 廖輝

[摘要]目的 利用高效液相色譜法比較不同直徑的化橘紅果實之間的柚皮苷含量差異。方法 采集25批不同直徑大小的化橘紅果實粉碎過三號篩，加甲醇超聲提取柚皮苷。采用Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇-6%醋酸水（35：65），流速1.0 ml/min，柱溫25℃，檢測波長283 nm，進(jìn)樣20 μl進(jìn)行檢測。結(jié)果 測定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=16.8568x+3.2460（r=0.9999），在0～80 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；最低定量濃度為6.67 μg/ml（信噪比為10：1）；3個濃度水平的平均加樣回收率為99.66%，RSD為1.2%；重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性等均符合要求。測得柚皮苷含量為3.26%～28.56%。結(jié)論 不同直徑的化橘紅果實之間柚皮苷含量差異顯著，化橘紅以幼果作為藥用資源值得推廣。

[關(guān)鍵詞]不同直徑；化橘紅果實；柚皮苷含量

[中圖分類號] R282.710.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）9（c）-0038-04

Comparison of naringin content in Exocarpium Citri Grandis fruits at different diameters

LI Qiong-xia1 LI Xiao-xin1 XIE Cheng-en1 LIAO Hui2

1. Department of Clinical Laboratory， Yuexiu Center for Disease Control and Prevention in Guangzhou City， Guangdong Province， Guangzhou 510055， China； 2. Department of Quality， Foshan Ziyunxuan Pharmaceutical Co. Ltd.， Guangdong Province， Foshan 528000， China

[Abstract] Objective To compare the difference in naringin content between fruits of Exocarpium Citri Grandis at different diameters using high performance liquid chromatography （HPLC）. Methods A total of 25 batches of Exocarpium Citri Grandis fruits at different diameters were crushed through No.3 sieve， and naringin was extracted by ultrasonic extraction with methanol. The column of Gemini C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used， the mobile phase was methanol and 6% acetic acid water with the ratio of 35：65， the flow rate was 1.0 ml/min， the column temperature was 25°C. The detection wavelength was 283 nm， and sample injection in 20 μl was for detection. Results The standard curve of the determination method was y=16.8568x+3.2460 （r=0.9999）， and the linearity was good in the range of 0-80 μg/ml. The lowest quantitative concentration was 6.67 μg/ml （signal to noise ratio was 10：1）. The average recovery rate of three concentrations was 99.66%， and the RSD was 1.2%. The repeatability， precision， and stability all met the requirements. The naringin content was between 3.26% and 28.56%. Conclusion There is a significant difference in the content of naringin in Exocarpium Citri Grandis fruits at different diameters， which is worth promoting young fruit of Exocarpium Citri Grandis as a medicinal resource.

[Key words] Different diameter； Exocarpium Citri Grandis fruit； Naringin content

近年來隨著化橘紅藥材的廣泛應(yīng)用，市售化橘紅藥材形態(tài)各異，或以果實或以果皮或以飲片形態(tài)出售[1-2]。市面上對化橘紅藥材果皮和果實的藥效性尚存在認(rèn)識不充足[3-4]。現(xiàn)行藥典收載的化橘紅藥材是化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外果皮，化橘紅果實并未作為有效部分收錄在《中國藥典》[5]。目前已有研究表明化州柚不僅僅是其外果皮，其果實也含有豐富的藥效成分[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)其含有豐富的黃酮類、多糖類、揮發(fā)油等成分[2-3，6-8]，其主要有效成分黃酮類以柚皮苷等形式存在[9-10]，柚皮苷占黃酮類物質(zhì)的主要比例[9-11]。柚皮苷是二氫黃酮類化合物，具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤和改善微循環(huán)抗過敏等功能[12-14]。在《中國藥典》[5]中，柚皮苷一直作為檢測化橘紅質(zhì)量的主要手段，本研究采集了不同果齡、不同直徑的化橘紅果實，對其主要藥效成分柚皮苷進(jìn)行研究比較，旨在深入研究化橘紅果實，加深對該藥材的認(rèn)識，闡明不同直徑的化橘紅果實與主要有效成分柚皮苷含量之間的關(guān)系，為推廣化橘紅藥材資源的合理應(yīng)用提供研究數(shù)據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1儀器與材料

1.1儀器

Agilengt1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）；HN1006超聲波清洗器（華南超聲設(shè)備廠）；MILLIPORE超純水機（密理博公司）；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2材料

柚皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110722-201613，含量94.3%）；甲醇（純度≥99.5%）。

1.3樣品

不同直徑化橘紅果實均購自廣東化州地區(qū)，經(jīng)廣州市藥品檢驗所中藥室候慧嬋主任中藥師鑒定，其為蕓香科植物化州柚的果實。其中樣品編號A1～A5來源于化州寶山區(qū)，A6～A10來源于化州平定鎮(zhèn)大嶺村，B1～B5來源于化州平定鎮(zhèn)瀚堂，B6～B10來源于化州平定鎮(zhèn)旺垌村，C1～C5來源于化州地區(qū)藥店。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相甲醇（A）-6%醋酸水（B）=35：65，等度洗脫，流速1 ml/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量20 μl，檢測波長283 nm。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品儲備液 精密稱取柚皮苷對照品8.50 mg，置100 ml容量瓶中，加70%甲醇適量使其溶解，并加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為柚皮苷儲備液（每毫升含柚皮苷約80 μg）。

2.2.2樣品溶液的制備 取樣品粉碎，過三號篩，精密稱取樣品細(xì)粉約1 g置于50 ml離心管中，加40 ml甲醇，超聲處理60 min，放冷，加甲醇稀釋定容至50 ml，搖勻濾過，精密吸取續(xù)濾液0.5～25 ml比色管中，加70%的甲醇定容至刻度。

2.3系統(tǒng)適用性考察

取對照品溶液、樣品溶液各20 μl進(jìn)樣，依法測定，結(jié)果提示，樣品溶液色譜中柚皮苷峰與其他峰的分離度良好，理論塔板數(shù)為6943，拖尾因子1.0，未出現(xiàn)干擾峰，方法專屬性良好（圖1、2）。

2.4線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1項”下的柚皮苷儲備液，分別置于10 ml容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，制備成0、8、16、24、32、40、80 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，注入色譜儀，記錄相應(yīng)的峰面積，以柚皮苷濃度（x）和峰面積（y）進(jìn)行線性回歸，得方程為：y=16.8568x+3.2460，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，提示柚皮苷在0～80 μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5檢測限和定量限考察

取柚皮苷濃度為8 μg/ml的對照品溶液，定量稀釋成系列溶液，依法測定，觀察柚皮苷出峰情況，得最低檢測濃度（信噪比3∶1）為2.00 μg/ml，最低定量濃度（信噪比為10∶1）為6.67 μg/ml。

2.6精密度試驗

取“2.2.1項”下的柚皮苷對照品溶液1份，依法連續(xù)進(jìn)樣6次，計算柚皮苷色譜峰面積，其RSD為0.3%，提示儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2項”下的1份樣品溶液分別于0、6、12、18、24 h進(jìn)樣測定，計算柚皮苷含量，其RSD為1.3%，提示樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗

取6份同一編號的樣品，每份約1 g，按照“2.2.2項”下的樣品溶液制備方法平行制備樣品，結(jié)果柚皮苷含量平均值為4.85%，RSD為2.0%，提示方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗

取2份已知含量的供試樣品，每份樣品稱3份，每份約1.0 g，分別進(jìn)行高、中、低濃度加樣回收率考察，按照“2.2.2項”下方法制備樣品溶液，并進(jìn)行測定，測得平均加標(biāo)回收率為99.66%，RSD為1.2%（表1），符合方法學(xué)要求。

2.10樣品中柚皮苷含量的測定

取25批化橘紅樣品，按照“2.2.2項”下方法制備樣品溶液，依法進(jìn)行測定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算柚皮苷含量，測得樣品中柚皮苷含量最低為3.26%，最高為28.56%（表2）。

2.11統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0，對化橘紅果實中的柚皮苷含量與果實直徑大小進(jìn)行直線回歸性分析，得出相關(guān)系數(shù)為r=-0.765，線性方程為y=-1.618x+19.171，R2=0.584；進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，以α=0.01為水準(zhǔn)，得出r=-0.765，P=0.000。柚皮苷含量（x）與果實平均直徑（y）的散點圖見圖3。

3討論

3.1樣品提取條件的選擇

化橘紅中柚皮苷為二氫黃酮類化合物，分子結(jié)構(gòu)中具有大量酚羥基，易溶于水、甲醇、乙醇等[12，15]。柚皮苷的提取有超聲波提取法、加熱回流提取法等[12，15-16]。本研究比較了兩種提取方法，提取效率相差不大，但超聲法更為方便簡捷。本研究采用甲醇超聲提取，對提取時間進(jìn)行單因素試驗，結(jié)果提示，提取1 h效果較好。

3.2高效液相色譜條件的選擇

在高效液相色譜測定條件的選擇中，考慮到柚皮苷為有機酸類分子[12]，流動相中加入6%乙酸，抑制有機酸的解離，增加其在固定相中的分離。實驗室常用流動相中有機相一般為甲醇、乙腈，本研究考察了甲醇-乙酸水，乙腈-乙酸水溶液流動相體系，結(jié)果提示，以甲醇-乙酸水（35∶65）作流動相時，柚皮苷與其他峰的分離度較好。文獻(xiàn)報道柚皮苷在紫外線283 nm波長下吸收最大[17-18]，本研究結(jié)果也提示，在波長283 nm處色譜圖柚皮苷峰清晰，其他雜質(zhì)峰較少。

3.3樣品含量結(jié)果分析

統(tǒng)計軟件SPSS 19.0直線相關(guān)性分析結(jié)果提示，相關(guān)系數(shù)r=-0.765，P=0.000。按α=0.01的水準(zhǔn)，認(rèn)為果實中柚皮苷含量與果實直徑成負(fù)相關(guān)。化橘紅果實柚皮苷含量與直徑大小成反比，果齡越長果實直徑越大，柚皮苷含量越低；當(dāng)果實直徑從12.5 cm減小到2.0 cm時，其含量從4.36%提高到28.56%。《中國藥典》2015年版一部中規(guī)定，化橘紅飲片中柚皮苷含量不得低于3.5%。本研究中樣本柚皮苷含量高于藥典標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)報道[19-20]。本研究采用化橘紅幼果全果采樣，而藥典及有關(guān)文獻(xiàn)采用外果皮及大果，有文獻(xiàn)報道，柚皮苷不完全是富集于化橘紅外果皮，其果瓤部分同樣富集該有效成分[3-4]。本研究也進(jìn)一步證實了幼果全果含有較高的有效成分。在后續(xù)的工作中，可以對幼果做藥理學(xué)研究，為推廣幼果作為藥用資源做進(jìn)一步的理論研究。

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（收稿日期：2018-05-04 本文編輯：孟慶卿）