利用雙電極電壓鉗檢測rs12899798單核苷酸多態性對α7煙堿受體功能的影響

薛奮勤 薛 冰

(首都醫科大學中心實驗室,北京 100069)

煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic receptor，nAChR)-α7廣泛分布于哺乳動物的大腦中，并在腦功能，尤其是學習和記憶中起重要作用。1個典型的nAChR由5個亞基組成[1]，這5個亞基可以是相同的(如α7)或不同的(如α4β2)。在哺乳動物的大腦中，主要的亞型是α4β2和nAChRs α7[2]。許多其他亞型以不同的α(2～10)和β(2～4)亞基進行組合，從而產生功能多樣性的離子通道蛋白。nAChR功能的微小變化，例如單一突變，可能對腦功能具有顯著影響[3]。

nAChR α7廣泛分布于中樞神經系統和自主神經節。這個受體比其他亞型的nAChR具有更高的鈣通透性[4]。除了興奮性突觸傳遞之外， nAChR α7還在遞質釋放，神經突生長，神經元存活和凋亡以及神經元可塑性中發揮重要作用[5]。 nAChR α7功能障礙與多種神經和精神疾病有關。

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)是同一物種個體之間DNA序列單堿基的變異。SNP的位置可以位于人類基因組的任何地方。在一個基因內，SNP可以位于內含子或外顯子中[6]。單核苷酸的錯義突變、插入或缺失將改變蛋白質序列，并且可能影響蛋白質表達和功能。通過檢索美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的SNP數據庫，筆者發現了一個導致α7亞基錯義突變的SNP位點W55G，它在受體蛋白上位于配體的結合區域。本研究利用雙電極電壓鉗檢測了W55G點突變對α7煙堿受體活化及脫敏等功能特性的影響。

1 材料與方法

1.1 突變體的構建和cRNA制備

將編碼人nAChR α7亞基的cDNA克隆到pGEMHE卵母細胞表達載體中。采用基于PCR的定點突變方法(Stratagene公司，美國)構建W55G突變體，并進一步進行測序驗證。接下來，將nAChR α7野生型和突變體載體通過NheI酶切而進行線性化后，使用T7 RNA聚合酶通過體外轉錄法而得到各自的cRNA；用DNA酶將DNA模板降解后，將cRNA純化并重懸于焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate， DEPC)水中。最后在1%(質量分數)瓊脂糖凝膠上查驗cRNA產量和完整性,在紫外光光度計(NanoDrop 2000/2000c， Thermo Fisher公司，美國)上測其濃度，并將RNA濃度分別調整至大約1 g/L備用。

1.2 非洲爪蟾卵母細胞制備和cRNA的注射

先用0.2%(質量分數)MS-222麻醉雌性非洲爪蟾，然后將卵巢葉取出并置于孵育緩沖液(82.5 mmol/L NaCl，2.55 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L CaCl2,1 mmol/L Na2HPO4,0.6 mmol/L 茶堿，2.5 mmol/L 丙酮酸鈉，5 mmol/L HEPES，50 mg/L慶大霉素，50 U/mL青霉素和50 mg/L鏈霉素，pH值為7.5。將卵巢葉切成小塊，并在室溫下用膠原蛋白酶消化1.5～2.0 h。選取VI期卵母細胞，用Nanoject微量注射系統(Drummond公司，美國)將cRNA注射其中(每個卵母細胞20～60 nL)，放入16 ℃的生化培養箱中搖蕩培養。

1.3 雙電極電壓鉗記錄

cRNA注射1～3 d后，室溫下(22 ℃)用雙電極電壓鉗記錄電流。電極內充灌3 mmol/L 的KCl溶液，使用GeneClamp 500B放大器(Axon Instruments公司，美國)，卵母細胞被鉗在-60 mV，以50 Hz對電流信號進行濾波。用Pclamp10.0來分析和處理電流數據。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 W55在α7亞基上的位置

W55在nAChR α7一級結構中和三維結構模型的位置見圖1。這個色氨酸殘基位于nAChR α7亞基的羧基端的loop D，是一個配體結合位點，在所有神經元nAChR亞基中都是保守的。

圖1 W55在nAChR α7一級結構和三維結構模型的位置Fig.1 Location of W55 in the receptor：sequence (loop D) and 3D modelLocation of the W55 in 1D (aligning with nAChR β2) and 3D structure of an nAChR α7 subunit；nAChR：α7 nicotinic receptor.

2.2 W55G突變使nAChR α7 對乙酰膽堿的敏感性降低，但增加了Imax

本研究在非洲爪蟾卵母細胞中表達了W55G突變體，并檢測了突變體對受體天然激動劑乙酰膽堿(choline,ACh)的劑量-效應關系。與野生型α7受體相比，需要更高濃度的乙酰膽堿才能刺激突變體受體W55G產生電流(圖2A)。突變體W55G的劑量-效應關系見圖2B。與野生型α7受體相比，其劑量-效應曲線右移數倍。野生型受體中乙酰膽堿的EC50為(210.5±24.3)μmol/L。相比之下，W55G突變體的EC50為(1 375.3±130.5)μmol/L，突變體對其天然神經遞質的敏感性降低6.5倍。

為了進一步檢測突變體對ACh的反應變化，在蛙卵中注射相同劑量的RNA,比較了ACh誘導的最大電流(Imax)。在注射2 d后，突變體受體中的Imax(由3.16 mmol/L Ach刺激誘導)顯著高于野生型(約6倍)(圖2C)。

2.3 W55G突變使nAChR α7 對膽堿的敏感性降低

野生型和突變體W55G對膽堿的電流反應情況見圖3A。與野生型受體相比，W55G的劑量-效應曲線明顯右移，突變受體對膽堿的敏感性也降低了(圖3B)。野生型對膽堿的EC50為(1 466.7±174.3)μmol/L，而W55G的EC50為(4 610.3±188.5)μmol/L，突變受體對膽堿的敏感性降低了約3.14倍。

圖2 W55G突變使nAChR α7對乙酰膽堿的敏感性降低Fig.2 W55G mutation reduced ACh sensitivity but with increased ImaxA：raw traces of ACh-induced currents in the oocytes expressing wild type (WT) and W55G mutant with increasing concentrations; B：averaged dose-response relationship of ACh in the two conditions.W55G mutant exhibited a -6.5 folds decrease of the acetylcholine sensitivity， ***P<0.001 vs wild type nAChR receptor; C：Mutant W55G showed significant increase in maximal current；nAChR：α7 nicotinic receptor； ACh：choline.

圖3 W55G突變使nAChR α7對膽堿的敏感性降低Fig.3 W55G mutation reduced choline sensitivityA：raw traces of choline-induced currents in the oocytes expressing wild type(WT) and W55G mutant with increasing concentrations; B：averaged dose-response relationship of choline in the two conditions.W55G mutant exhibited a -3.14 folds decrease of the choline sensitivity.***P<0.001 vs nAChR receptor；nAChR：α7 nicotinic receptor.

2.4 W55G突變改變了nAChR的脫敏動力學

本研究比較了nAChRα7野生型和突變體W55G的電流曲線，對于突變體W55G，盡管使用了較高濃度的乙酰膽堿，但其脫敏動力學仍然較野生型受體顯慢(圖4A)。圖4B中擬合得到了通道脫敏的時間常數，結果表明：野生型nAChR α7的時間常數為(173.17±28.08)ms (n=4); W55G突變體的時間常數為(785.49±78.20)ms (n=4)。W55G突變體時間常數明顯比野生nAChR更高，其脫敏速率變慢。

3 討論

本研究發現nAChR α7中SNP導致的W55G突變顯著降低了對其天然配體乙酰膽堿和膽堿的敏感性，并且增加了Imax，而且該突變使受體對于乙酰膽堿的脫敏速率變得較慢。這些功能的改變可能重塑突觸后反應，對于腦疾病的發生可能會有較大影響。

nAChR α7具有比其他亞型nAChR更高的鈣通透性[4]。除了興奮性突觸傳遞之外，它還在遞質釋放，神經突生長，神經元存活和凋亡以及神經元可塑性中發揮重要作用[7]。nAChR α7功能障礙與多種神經和精神疾病有關。例如，分析顯示nAChR α7可能與精神分裂癥有關[8]，nAChR α7蛋白所對應的缺失與癲癇發作和智力低下有關[9-10]。盡管沒有關于nAChR α7與阿爾茨海默病的遺傳關聯的報道，但膽堿能神經元的退化伴隨著nAChR的丟失，并且與典型的臨床癥狀相關[11]，例如學習和記憶能力受損，以及認知能力逐漸下降。因此，nAChR功能的微小變化，例如單一突變，可能對認知功能沒有顯著影響，可能會有緩慢的作用，導致神經元逐漸喪失，隨著衰老而變得更加明顯。

圖4 W55G突變改變了nAChR α7的脫敏動力學Fig.4 W55G mutation altered desensitization kinetics of nAChR α7A：Typical current traces induced by high concentration of Ach (10 mmol/L) for wild type (WT) nAChR α7 and its mutant W55G; B：Current traces were fitted.***P<0.001 vs wild type nAChR α7；nAChR：α7 nicotinic receptor.

SNP是同一物種個體之間DNA序列單堿基的變異。 SNP的位置可以位于人類基因組的任何地方。在一個基因內，SNP可以位于內含子或外顯子中。內含子中的SNP可影響RNA剪接效率或改變RNA剪接模式。外顯子中的SNP可位于蛋白質編碼區或5′/ 3′非翻譯區(untranslated region，UTR)中。編碼區中的SNP可能導致突變，插入或刪除。在nAChR亞基的編碼區域中，近一半的突變是同義或沉默突變，DNA序列中突變為相同氨基酸殘基的不同密碼子。然而，單核苷酸的錯義突變，插入或缺失將改變蛋白質序列，并且可能影響蛋白質表達或功能。

色氨酸殘基被認為是結合和通道門控中的重要殘基。它在所有神經元nAChR亞基中較為保守。然而，在人群中天然存在的W55G突變體沒有普遍認可和充分表征。它對受體通道功能的影響不得而知。本研究在體外表達并用雙電極電壓鉗檢測nAChR α7突變體的性質，這對接下來研究該突變體對疾病的影響有重要的意義。