超聲二維斑點追蹤技術分析小鼠頸動脈僵硬度的方法學研究

許 晴 劉麗娜 宋妍婷 曲愛娟

(1.首都醫科大學中心實驗室, 北京 100069；2.首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系 重塑相關心血管疾病教育部重點實驗室 代謝紊亂相關心血管疾病北京市重點實驗室，北京 100069)

動脈僵硬度升高是心血管疾病發病和死亡的獨立危險因子[1]。臨床上，動脈僵硬度的改變被認為發生在心血管疾病之前。因此，評估動脈僵硬度可以預測并最終預防心血管疾病[2]。脈搏波傳導速度(pulse wave velocity，PWV)是無創性檢測動脈僵硬度的最常用指標[3]。超聲影像學二維斑點追蹤技術(2D-speckle tracking，2D-ST)為近年來發展的一種定量、客觀的測量心血管生物力學的技術，可無創傷定量評價局部心肌運動及功能，尤其是可以在整體功能改變前先發現節段功能異常，并能定量分析血管力學[4]。目前，該技術已應用于科研小動物心血管超聲檢測領域。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除(ApoE-/-)小鼠可自發形成動脈粥樣硬化, 是動脈粥樣硬化研究常用模型。本研究利用超高頻超聲2D-ST技術分析ApoE-/-小鼠頸動脈僵硬度的相關指標，探索評估小鼠頸總動脈管壁僵硬度特征的可行性，探討正常小鼠與ApoE-/-小鼠頸動脈僵硬度的差別，同時為相關課題的研究提供準確的影像學數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用C57B1 /6J 雄性小鼠，8周齡，6只，體質量(24.48±1.59)g。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠，60周齡，6只，體質量(27.7±1.06)g。北京市實驗動物質量合格許可證編號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器

應用超高分辨率小動物彩色多普勒超聲成像系統(Vevo 2100 Imaging System, FUJIFILM VisualSonics Inc., 美國)，MS-700高頻寬帶電子線陣探頭。探頭中心頻率50 MHz；軸向分辨力和橫向分辨力分別為30 和75 μm。超聲波速度1 540 m/s。

1.2.2 小鼠血壓測量

采用無創尾套法(美國Visitech System BP-2000血壓儀)進行血壓測量。實驗前1周每日固定時間訓練小鼠鉆籠，正式實驗時每日在相同時間盡量以相同方式相同操作進行血壓測定，待小鼠狀態穩定后，每只實驗小鼠每次重復測量連續穩定的血壓5次，記錄收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、平均動脈壓(mean blood pressure, MBP)、心率(heart rate, HR)值和血壓波形圖并進行數據統計分析。

1.2.3 2D-ST技術評價血管僵硬度

將小鼠放入麻醉誘導箱內，調節氧氣至1L/min，調節異氟烷(the Isoflurane，魯南貝特制藥有限公司)至2.5%。當小鼠麻醉后，輕輕取出動物，使之仰臥位于小鼠專用操作臺(Mice Handling and physiological Monitoring Platform)，將小鼠的鼻口部置于麻醉面罩內，調節異氟烷的維持量為1.0%～1.5%。使用脫毛膏脫去小鼠頸部的毛發。探頭切記朝向小鼠下顎，縱向掃查以確定左頸動脈位置。清晰顯示頸動脈，調整探頭，使超聲束垂直于左頸總動脈前后壁，顯示血管前、后壁的內中膜。在二維超聲模式下，啟動EKV(ECG-based Kilohertz Visualization)模式，調整參數，存儲左頸動脈長軸觀EKV二維動態圖像。同時記錄心電圖。在采集圖像期間，調整麻醉深度。所有圖像均經有效數據存儲以備線下分析。

1.2.4 數據處理

將存儲的EKV二維動態圖像導入VevoLAB離線工作站，使用血管應變專用分析軟件VevoVasc進行分析(版本3.1.1，FUJIFILM VisualSonics Inc., 美國)。在獲取的頸動脈長軸觀EKV二維動態圖像上，于舒張末期自頸動脈分叉處向近心端手動勾畫血管內外膜邊界，調整取樣厚度，生成包含血管內膜、中膜和外膜解剖結構的感興趣區域。應用2D-ST技術血管壁追蹤檢測工具跟蹤血管壁的運動變化。測量并計算內中膜厚度(intima-media thickness, IMT)、血管平均面積、血管平均直徑及面積變化率和直徑變化率等參數。輸入血壓值，計算血管擴張性。同時記錄血管壁整體徑向應變隨時間變化曲線并計算相應數值。同時，在頸動脈長軸觀EKV二維動態圖像上手動畫出等長選框作為感興趣區域，進入M-mode界面，準確界定ΔT，計算PWV。上述每一個數據均測量3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 超聲影像下頸動脈形態學觀察

應用高分辨率小動物超聲影像系統可以清晰顯示小鼠頸總動脈及頸內、頸外動脈。正常小鼠管壁光滑(圖1A)，ApoE-/-小鼠近頸動脈分叉處可見明顯斑塊(圖1B，箭頭所示)。頸動脈管壁分為3層，其中內膜為中等回聲，外膜為強回聲，內外膜之間的中膜為低回聲或無回聲。M-型超聲影像圖可見相對聲束遠場的管壁結構更清晰，與正常小鼠(圖1C)相比，ApoE-/-小鼠頸動脈IMT明顯增厚(圖1D)。

2.2 小鼠血壓及血管成像分析

與正常小鼠相比，ApoE-/-小鼠IMT增加，面積變化率和直徑變化率明顯下降，血管擴張性顯著降低，詳見表1。

2.3 應用超聲二維斑點追蹤技術分析小鼠頸動脈應變及脈搏波傳導速度

超聲二維斑點追蹤圖像下，頸總動脈結構清晰，可見前壁外膜(紅色)，前壁內膜(藍色)，后壁外膜(綠色)，后壁內膜(黃色)(圖2A、B)。血管壁包含很多均勻分布的聲學斑點，這些聲學斑點與組織同步運動。應用2D-ST技術在超聲圖像中辨認這些斑點，并追蹤斑點的運動，從而得到組織的運動參數。以向量的形式顯示血管壁實時的運動方向及運動速度，兩組小鼠頸動脈血管壁各部分以向量形式顯示的運動速度均一，方向一致(圖2A、B)。C57小鼠應變時間曲線陡峭，峰值明顯(圖2C)。ApoE-/-小鼠頸動脈血管壁應變時間曲線趨于平直，應變值降低，結果差異有統計學意義[(41.64±8.51)%vsC57小鼠(66.97±10.28)%,n=6,P<0.05](圖2D，圖3)。檢測結果顯示，ApoE-/-小鼠與C57正常小鼠相比，脈搏波傳導速度明顯加快[(3.09±0.23)m/svsC57小鼠(1.90±0.37)m/s，n=6,P<0.05](圖3)。

圖1 應用超高分辨率超聲影像系統獲得頸動脈縱向二維超聲影像圖及M-型超聲影像圖Fig.1 Representative images of longitudinal B Mode and M mode for common, left internal, and external carotid arteries using the Vevo 2100 with the MS-700 at a center frequency of 50 MHzA：longitudinal B mode image for carotid arteries of C57Bl/6J mice；B：longitudinal B mode image for carotid arteries of ApoE-/- mice with the atherosclerotic plaques (red arrow)；C：M mode image for carotid arteries of C57Bl/6J mice；D：M mode image for carotid arteries of ApoE-/- mice with the thickened intima-media (red arrow).

表1 兩組小鼠頸動脈常規超聲參數及血壓Tab.1 Conventional echocardiographic data in C57B1 /6J or ApoE-/- mice

圖2 應用MS-700探頭2D-ST技術分析小鼠頸總動脈血管壁應變Fig.2 2D-ST carotid artery global radial strain curves using the Vevo 2100 with the MS-700 at a center frequency of 50 MHzMotion of the vessel wall for C57Bl/6J (A) and ApoE-/- (B) mice with velocity vectors and lines overlaid on B-mode data.Time-dependent graphs of global radial strain for C57Bl/6J (C) and ApoE-/- (D) mice

圖3 ApoE-/-小鼠與C57B1/6J小鼠的應變值與PWV值比較Fig.3 Comparison of global radial strain and PWV*P<0.05 vs C57B1/6J group; PWV：pulse wave velocity.

3 討論

血管僵硬度與心血管事件的密切關系是當前臨床研究的重點，可以有效準確反映動脈結構和功能變化[5-6]。2D-ST是一個全新的超聲定量分析工具，能夠識別灰度圖像中的特定聲學標記(即斑點)，并在整個心動周期中逐幀地跟蹤它們，其優點在于它跟蹤的是二維物體，沿著室壁或血管壁的方向，而不是沿著超聲束，不受聲束方向與室壁或血管壁運動方向之間夾角的影響，是能更準確反映彈性的方法[7-8]。本研究中，筆者應用先進的2D-ST技術對正常C57小鼠及ApoE-/-小鼠頸動脈管壁進行自動實時檢測和管壁運動追蹤，從小鼠血管IMT、直徑和面積變化率、擴張性、PWV、應變等多指標對小鼠頸動脈的僵硬度進行較全面的精確量化分析和準確評估。

小鼠體積小，正常小鼠頸動脈直徑只有0.5 mm左右。臨床用超聲探頭無法滿足小動物器官清晰成像的要求。小動物專用超高頻超聲影像系統，利用其超高頻超聲波(30.0～82.5 MHz)，分辨率高達30μm，能夠得到小實驗動物器官的清晰圖像。從而使小實驗動物心血管系統超聲檢測的精確定量分析成為可能[9]。許多小動物心血管疾病模型都會有大血管病變，如高血壓模型、動脈粥樣硬化模型等。在以往對這些模型的超聲測試中，由于超聲模塊的限制，只能做常規指標的檢測。如應用B型超聲檢測小鼠血管的切面影像，測量動脈管壁的厚度，管腔的大小，動態觀測動脈粥樣硬化斑塊的形成與消融。應用彩色多普勒和脈沖多普勒對血流量和血流速度等變化的量化分析等。這些超聲檢測結果，必須在血管結構發生改變之后才能有統計學意義。因此，開發用于早期診斷血管病變的非侵入性的方法具有重要的臨床意義[10]

ApoE-/-小鼠由于載脂蛋白E 基因敲除，導致在血液循環過程中，富含膽固醇的物質容易積累。無論正常或高脂飲食均可形成嚴重的高脂血癥[11-12]，因而成為理想的動脈粥樣硬化常用小鼠。載脂蛋白E 基因敲除小鼠在普通飲食下，早期主要表現為IMT厚度的變化，隨著病程進展，動脈粥樣硬化程度逐漸加重, 經歷了從脂質條紋到粥樣斑塊形成這個典型的動脈粥樣硬化病理過程。因此筆者以研究動脈粥樣硬化常用的ApoE-/-小鼠為研究對象探討了應用高分辨率2D-ST技術評估血管僵硬度的方法。動脈硬化的共同特點是動脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小。大動脈中所含的彈性纖維比例較大，從而具有較大的彈性。本研究結果顯示，ApoE-/-小鼠與正常小鼠相比，頸動脈IMT明顯增厚，可見斑塊，血管直徑變化率及面積變化率下降，動脈彈性降低，血管的擴展能力顯著下降，分析原因在于平滑肌細胞的增生和膠原纖維的增多，取代了彈性纖維，導致血管壁的彈性降低。

本研究中，筆者檢測了動脈僵硬度的指標，即檢測了兩組小鼠的PWV、血管擴張性，進一步量化小鼠腹主動脈僵硬度。動脈壁是動脈硬化的始發部位，其功能或結構改變成為篩查早期血管病變的重要靶點[13]。大動脈血管具有彈性貯器作用和順應性。脈搏波沿動脈管壁傳播，主要與血管的順應性有關。PWV是血壓波動通過動脈系統內給定兩點距離間的傳導速度，與動脈擴張性和僵硬度密切相關[14-15]。動脈僵硬度又稱動脈彈性、動脈順應性。動脈的順應性值越大，動脈的可擴張能力越大。動脈硬化發生時，血管壁纖維組織不斷增生，血管僵硬度增加，順應性逐漸變小，大動脈彈性貯器的作用也就相應減弱，脈搏波被血管壁吸收減少，因此脈搏波傳導速度加快[16-17]。本研究結果顯示，ApoE-/-小鼠血管擴張性降低，頸動脈順應性減弱，動脈擴張性減低，因而PWV增快。上述指標均反映了ApoE-/-小鼠頸動脈僵硬度增加。

臨床上已有大量應用2D-ST技術進行血管結構和功能測量的研究報道[18]。由于臨床儀器的限制，實驗小動物相關研究數據還非常少。最新的小動物高頻超聲2D-ST技術已允許在徑向測量血管壁運動。應變被定義為在壓力的作用下伸長或縮短變化的百分率。垂直于血管壁并使管壁保持一定形態作用的應力被稱作為徑向應力，產生徑向應變[18]。2D-ST技術在超聲圖像中辨認血管壁上的聲學斑點，并追蹤斑點的運動，應用空間與時間圖像處理算法逐幀追蹤其幾何位置的移動[19-21]，是被認為能夠更準確反映血管彈性的方法。本研究中筆者運用2D-ST技術詳細分析了頸動脈在沿血管直徑組織形變的情況。捕獲關于動脈壁在該方向上的特定運動的信息。研究結果顯示，40周齡ApoE-/-小鼠頸總動脈血管壁整體徑向應變減低。說明ApoE-/-小鼠頸動脈血管壁沿血管壁直徑的方向伸長或縮短的運動能力下降。與其直徑及面積變化率降低，擴張性降低相一致，即血管彈性降低，僵硬度增加。

本研究應用超高頻探頭及能契合實驗小動物高心率的專用超聲儀清晰顯示小鼠血管結構及分析其功能，對應用超聲二維斑點追蹤技術評價小鼠頸動脈血管壁僵硬度進行了有益的探索，證實了該應用的可行性，從血管形態學、PWV、血管擴張性、血管壁運動特征等多方面在體無創檢測了實驗小動物的血管僵硬度，并建立了正常的參考水平。這些參數均可作為評價頸動脈彈性的指標，該結果還支持小動物高頻超聲可作為在體非侵入性地量化小鼠頸動脈應變的新興工具。

二維斑點追蹤技術圖像清晰性的要求較高，首先需保持圖像清晰。其次盡量使頸動脈長軸平行于屏幕，以減少測量時調整取樣框角度，保證數據的準確性。