微小RNA—221在非小細胞肺癌中的表達及意義

賀家勇　楊晨晨　徐茜

[摘要] 目的 探討微小RNA-221（miRNA-221）在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達及意義。 方法 收集新疆醫科大學附屬腫瘤醫院2010年1月～2011年1月接受肺葉切除+系統性淋巴結清掃的53例NSCLC患者的臨床資料。采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測上述NSCLC組織及癌旁組織標本中miRNA-221的水平。分析miRNA-221表達水平與各臨床病理參數的關系，采用Kaplan-Meier方法分析miRNA-221表達與NSCLC生存期（OS）之間的關系。 結果 miRNA-221在NSCLC組織中的相對表達量為（0.0234±0.0002），在癌旁組織中的相對表達量為（0.0095±0.0003），miRNA-221在NSCLC組織中的相對表達量高于癌旁組織（P < 0.05）。31例miRNA-211相對高表達。TNM分期中Ⅲ期患者miRNA-221的表達量高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P < 0.05）。Kaplan-Meir生存分析結果顯示，miRNA-221高表達患者中位OS為36.4個月，miRNA-221高表達與低表達患者OS差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 miRNA-221是潛在的肺癌預后預測分子標志物，miRNA-221可能參與了NSCLC的發生、發展。

[關鍵詞] 微小RNA-221；非小細胞肺癌；表達

[中圖分類號] R734 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）11（b）-0097-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of microRNA-221 in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods A total of 53 NSCLC cases′ clinical material were collected from Cancer Hospital Affiliated of Xinjiang Medical University from January 2010 to January 2011， and all the cases accepted pulmonary lobectomy and systematic mediastinal lymphadenectomy. Levels of miRNA-221 in the NSCLC and adjacent tissues were examined by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The relationship between expression level of miRNA-221 and clinic pathological parameters were analyzed. Kaplan-Meier was used to analyze the relationship between miRNA-221 expression and overall survival （OS）. Results The relative expression of miRNA-221 in NSCLC tissues was （0.0234±0.0002）， and it was （0.0095±0.0003） in adjacent tissues. The relative expression of miRNA-221 in NSCLC tissues was higher than that in adjacent tissues （P < 0.05）. There were 31 cases having relative higher expression. The level of miRNA-221 was significantly higher in TNM stage Ⅲ than that in TNM stage Ⅰ-Ⅱ（P < 0.05）. Kaplan-Meir survival analysis results manifested that the median OS of patients with miRNA-221 high expression was 36.4 months. There was no significant difference in OS between miRNA-221 low expression and high expression patients（P > 0.05）. Conclusion miRNA-221 is a potential molecular marker for the prognosis of lung cancer， which may be involved in the development and progression of NSCLC.

[Key words] Micro RNA-221； Non-small cell lung cancer； Expression

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發病占所有肺癌發病的85%，NSCLC患者的5年生存率仍不到15%[1-3]，對NSCLC預后分子標志物的判斷有助于NSCLC的早期診斷和提高患者的總生存時間[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為24～25個核苷酸的內源性非編碼小分子單鏈RNA[5]，多項研究證明miRNA在癌癥的發生、發展中起重要作用[6-8]。miRNA通過結合mRNA3′-UTR非翻譯區（3′-UTR）導致mRNA的降解或翻譯抑制而調控靶基因的表達。miRNA-221是其中重要的miRNA，研究表明，miRNA-221是一種致癌miRNA[9-10]，miRNA與肺癌的關系文獻目前鮮有報道。本研究回顧性分析53例NSCLC患者的臨床資料，檢測miRNA-221在肺癌組織中的表達情況，探討miRNA-221與肺癌的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

篩選新疆醫科大學附屬腫瘤醫院2010年1月～2011年1月接受標準肺癌根治術（肺葉切除+系統性縱隔淋巴結清掃）的NSCLC鱗癌腺癌患者106例，并進行電話隨訪。納入標準：完成隨訪病例；Ⅱ、Ⅲ期[11]患者術后接受過系統性含鉑方案兩藥聯合化療4周期；Ⅰ期患者術后隨訪至腫瘤復發后才接受全身化療；有癌組織和癌旁組織病理標本的患者。共納入53例，平均年齡（55.8±9.7）歲；男29例，女24例；Ⅰ期患者25例，Ⅱ期16例，Ⅲ期12例（UICC第2007版）；鱗癌24例，腺癌29例。

1.2 隨訪情況

53例NSCLC患者術后采用電話隨訪形式。隨訪時間自手術之日起，至2017年1月1日。終點事件為患者死亡。評價指標為患者1、2、3年總生存（OS）率。

1.3 主要儀器及試劑

miRNA反轉錄試劑（Thermo，立陶宛），miR cute miRNA提取分離試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，熒光定量PCR儀[羅氏診斷產品（上海）有限公司，型號：IQ5]，臺式高速冷凍離心機（Eppendorf艾本德中國有限公司，miRNA-221引物、內參U6引物[寶生物（大連）有限公司]，紫外分光光度儀（上海棱光技術有限公司）。

1.4 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）方法

1.4.1 蠟塊組織總RNA提取 采用miRNAeasy總RNA提取試劑盒提取NSCLC及癌旁正常石蠟組織總RNA，操作嚴格按照說明書進行，測定每個樣本在OD260/OD280 nm處的吸光度值，核酸蛋白檢測要求A260/A280在1.8～2.0之間，計算miRNA的濃度。將提取的DNA用cDNA試劑盒反轉錄成cDNA，樣本置-80℃冰箱保存。

1.4.2 RT-PCR檢測 PCR總反應體系：20 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，其余加ddH2O補足，2×qPCR Mix 10 mL，以U6為內參，擴增條件：95℃預變性3 min，然后95℃ 20 s、60℃ 20 s、72℃ 40 s，進行40個循環，獲得Ct值。miRNA各引物序列見表1。

1.4.3 數據分析 分析目的基因的表達水平是以U6作為內源參照。△Ct（n）=目的基因Ct（n）均數-參照基因Ct（n）均數；△△Ct（n）=△Ct（n）-△Ct（1）；然后算出2-△△Ct。將2-△△Ct中位數作為分界值（0.0124）。將患者分為miRNA-221低表達組和高表達組，≥0.0124為高表達組，<0.0124為低表達組。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行統計分析，癌組織及癌旁組織中的miRNA的表達量比較采用t檢驗，分析miRNA-221表達與臨床病理學參數的關系采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meir方法進行生存分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-221在肺癌及癌旁組織中的表達情況

采用2-△△Ct法計算出miRNA-221相對內參U6的相對表達量，結果顯示，相對于內參U6，miRNA-221在NSCLC組織中的相對表達量為（0.0234±0.0002），在癌旁組織中的相對表達量為（0.0095±0.0003），miRNA-221在NSCLC組織中的相對表達量高于癌旁組織，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.2 miRNA-221與NSCLC臨床病理學特征的關系

53例NSCLC組中，32例miRNA-211相對高表達，統計結果顯示，miRNA-211的表達與患者年齡、性別、吸煙情況、病理類型無關（P > 0.05）。而miRNA-221的表達與患者TNM分期有關，TNM分期Ⅲ期miRNA-221的表達量高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 不同miRNA-221水平NSCLC患者的生存分析

Kaplan-Meir生存分析結果顯示，miRNA-221高表達患者中位OS為36.4個月，miRNA-221高表達與低表達患者OS差異無統計學意義（P = 0.544）。見圖1。

3 討論

越來越多的研究表明，miRNA可作為潛在的癌基因（OncomiR）或抑癌基因。miRNA-221和miRNA-222是兩種亮度同源的miRNA，miRNA-221屬于miRNA-221/222家族，miRNA-221編碼的基因位于染色體XP11.3[12-15]，miRNA-221與多種腫瘤有關，如miRNA-221在大多數上皮性腫瘤中過表達[16]，并且miRNA-221可能是上皮瘤治療的潛在靶點。Galardi等[17]研究顯示，在前列腺癌細胞中miRNA-221出現過表達，導致細胞增殖，并導致細胞周期的改變。在惡性膠質癌、甲狀腺乳頭狀癌、乳腺癌、肝細胞癌中也得到了證實。吳展陵等[18]研究結果顯示，miRNA-221過表達能夠增強NSCLC NCI-H1299細胞的活力和增殖能力，P27是NCI-H1299細胞中miRNA-221的靶基因，兩者存在負調控關系，提示miRNA-221可以促進NSCLC NCI-H1299細胞的生長，可作為NSCLC基因治療的靶點。

本研究采用qRT-PCR的方法統計了53例NSCLC組織及正常組織的miRNA-221表達水平，發現miRNA-221在NSCLC癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，miRNA-221在NSCLC中的表達與腫瘤臨床分期相關，臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期患者miRNA-221陽性表達水平明顯高于臨床分期Ⅰ、Ⅱ期。進一步分析結果顯示，miRNA-221在不同年齡、性別、組織學類型、病理特征間的表達水平，差異無統計學意義（P > 0.05），因此miRNA-221可能參與了NSCLC的發生、發展。另外，miRNA-221與NSCLC的預后有關，miRNA-221低表達的患者OS長，呂俊杰等[19-21]研究報道，miRNA-211高表達組中位OS為35.34個月，較miRNA-221低表達組（平均48.72個月）明顯縮短，兩組OS差異有統計學意義（Log-rank檢驗：P = 0.006）。miRNA-221在一定程度上可作為NSCLC的腫瘤標志物。本研究結果顯示，miRNA-221高表達組患者較miRNA-221低表達組患者中位OS短，但差異無統計學意義（P > 0.05），這與呂俊杰等[19]報道有一定差異，可能與病例來源不同或者病例數量較少有關，還需進一步的研究。

miRNA-221對NSCLC細胞增殖、周期的影響以及可能與哪種基因存在靶向調控關系，仍需進一步研究。本研究提示miRNA-221與NSCLC細胞周期、凋亡有關，在細胞水平驗證了miRNA-221的作用。此外，miRNA可以特異性地識別靶mRNA的3′-非翻譯區（3′-UTR），并與之結合，促進靶基因的降解或翻譯、抑制而發揮負調控基因表達的作用[22-24]。相關研究[25-26]報道，miRNA-221通過與靶基因PTEN的3′-UTR結合通過上調PTEN，在口腔鱗狀細胞癌中起到促進凋亡的作用，后續可進行miRNA-221與靶基因調控作用的研究。

綜上，miRNA-221在NSCLC中的表達量明顯上調，提示miRNA-221在NSCLC中充當癌基因作用，并且在腫瘤發生、發展中可能發揮促癌作用，可作為一個潛在的預測預后因素。

[參考文獻]

[1] 耿立國.早期非小細胞肺癌預后影響因素及預測方法研究[D].南京：南京醫科大學，2017.

[2] 萬海江.對一例左肺癌老年患者化療方案優化的藥學服務[J].中國農村衛生，2017，5（24）：94-95.

[3] 賀加貝.NSCLC患者血漿和腫瘤組織中PD-1、PD-L1的表達水平和臨床意義的研究[D].北京：北京市結核病胸部腫瘤研究所，2016.

[4] 李猶龍，范江.5種miR表達對NSCLC患者臨床預后的影響[J].熱帶醫學雜志，2016，16（12）：1498-1500.

[5] 張鑫，惠越，張燕，等.MicroRNA-21與細胞損傷及凋亡的研究進展[J].重慶醫學，2017，46（1）：120-123.

[6] Pan YJ，Zhuang Y，Zheng JN，et al. MiR-106a：Promising biomarker for cancer [J]. ACS Med Chem Lett，2016，26（22）：5373-5377.

[7] 王亞偉.RYBP在乳腺癌中的作用及相關miRNA調控機制研究[D].長春：吉林大學，2017.

[8] Qin Q，Wei F，Zhang J，et al. miR-134 suppresses the migration and invasion of non small cell lung cancer by targeting ITGB1 [J]. Oncol Rep，2017，37（2）：823-830.

[9] 李鋒，宋文娜，張秋月，等.探究miR-221在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其與患者臨床資料和預后的關系[J].養生保健指南，2017（34）：49.

[10] Abak A，Amini S，Estiar MA，et al. Analysis of miRNA-221 Expression Level in Tumors and Marginal Biopsies from Patients with Breast Cancer（Cross-Sectional Observational Study）[J]. Clin Lab，2018，64（1）：169-175.

[11] 葉波，楊龍海，劉向陽.最新國際肺癌TNM分期標準（第7版）修訂稿解讀[J].中國醫刊，2008，43（1）：21-23.

[12] 彭馥芝，冉茂良，翁波，等.miR-221/222基因家族進化分析及其在豬睪丸組織中的表達變化[J].經濟動物學報，2017，21（1）：33-40.

[13] 彭武建，譚奎璧，黃建溶.非IgA系膜增生性腎小球腎炎患者全基因組miRNA表達譜的特征[J].中國當代醫藥，2016，23（18）：4-7.

[14] 張青，仇誠，夏東彥，等.miR-221/miR-222家族在神經膠質瘤患者腦脊液中的表達及其診斷價值[J].臨床神經外科雜志，2017，14（6）：401-405.

[15] 周寧.選擇性抑制miR-221對卵巢癌細胞增殖、遷移能力的作用[D].石家莊：河北醫科大學，2016.

[16] 尹杰，白志剛，蔡軍，等.血清MicroRNA作為結直腸癌肝轉移患者早期診斷標志物的探索性研究[J].臨床和實驗醫學雜志，2016，15（2）：97-101.

[17] Galardi S，Mercatelli N，Giorda E，et al. miR-221 and miR-222 Expression affects the proliferation potential of human prostate carcinoma cell lines by targeting p27Kip1 [J]. J Biol Chem，2007，282（32）：23 716-23 724.

[18] 吳展陵，鐘敏華.MicroRNA-221對非小細胞肺癌NCI-H1299細胞生長的影響及其機制研究[J].解放軍醫藥雜志，2016，28（6）：36-40.

[19] 呂俊杰，徐磊，許有濤，等.非小細胞肺癌組織miRNA-221表達及其與預后的關系研究[J].中國肺癌雜志，2014， 17（3）：221-225.

[20] 羅家友，周凌燕，張麗娟，等.呼出氣冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21檢測對孤立性肺結節早期肺癌的診斷價值及臨床相關性研究[J].中國現代醫生，2018，56（7）：5-8，169.

[21] 張書新，劉陽.高通量微RNA表達譜檢測在肺癌臨床應用中的研究進展[J].醫學綜述，2016，22（7）：1323-1326.

[22] 靳松，黃愛軍，林昆，等.miR-124靶向抑制NFATc1調控小鼠C3H10T1/2細胞軟骨分化的研究[J].新醫學，2018， 49（1）：36-41.

[23] 林在楷，周琨，陸霽，等.ROC曲線分析miRNA-221/222作為侵襲性甲狀腺乳頭狀癌診斷標志物的臨床價值[J].癌癥進展，2018，16（1）：49-52.

[24] 余梟鳳，張月飛.miR-203在惡性腫瘤中的作用及其相關靶基因的研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志，2017，31（5）：506-509.

[25] Zhou L，Jiang F，Chen X，et al. Downregulation of miR-221/222 by a microRNA sponge promotes apoptosis in oral squamous cell carcinoma cells through upregulation of PTEN [J]. Oncol Lett，2016，12（6）：4419-4426.

[26] 李薇，劉天華，張舒，等.腫瘤轉移相關糖基轉移酶表達調控研究進展[J].中國臨床醫學，2016，23（2）：233-236.

（收稿日期：2018-04-25 本文編輯：金 虹）