2016年-2017年吉安市乙型流感病毒基因特性分析

劉麗 ，孫愛猛 ，羅青 ，朱端昊 ，李健雄 ，施勇 ，周信云 ，馮萍英 ，羅瀅娟

(1、吉安市疾病預防控制中心，江西 吉安 343000；2、江西省疾病預防控制中心，江西 南昌 330029)

乙型流感病毒是引起人流行性感冒的重要病原，致病性較強，人普遍易感，只在人間傳播，常呈暴發或小流行。其在世界范圍內多個國家都有過流行，我國在1994年、1997年、和2000年出現乙流高峰，2005年呈引起小規模暴發[1]，近年來我市監測的流感樣病例陽性標本中，乙型流感病毒占居較大比例，2016年為我市優勢型別，且在2016年3月及2017年12月均出現過乙型流感病毒引起的局部流行。流感病毒的抗原漂移性強，易發生變異，及時正確掌握流感流行及變異趨勢，對預防和控制流感大流行具有重要的作用。本文通過對吉安市2016年-2017年分離到的乙型流感病毒的HA（血凝素）和NA（神經氨酸酶）進行基因測序，分析其系統進化及分子變異特征，了解乙型流感病毒的基因特點，為吉安市流感流行的防控工作提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本選擇我市2016年-2017年不同時間段的流感樣病例監測及疑似流感疫情咽拭標本中分離到的乙型流感病毒，進行基因擴增和測序。

1.2 病毒RNA提取采用德國QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit對選取的乙型流感病毒毒株進行病毒RNA提取，具體步驟參考試劑說明書。

1.3 引物 基因測序引物序列參考WHO[2]，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 基因RT-PCR擴增 擴增采用Qiagen One Step RT-PCR Kit試劑盒進行RT-PCR反應，RT反 應 條 件 ：60℃ ，1min；42℃ ，10min；50℃ ，30mm；95℃，15min，PCR 循 環 條 件 ：94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min，循環 35 次，72℃ 10min。

1.5 核苷酸序列測定PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行雙向測定。

1.6 序列分析采用DNAStar5.0、Mage6.0軟件對測序結果進行拼接及分析。從Influenza Sequence Database中下載B/Brisbane/60/2008（2016年-2018年度疫苗株，Victoria 系，CY115151，CY115153），B/Phuket/3073/2013（2016年-2018年度疫苗株，Yamagata 系，EPI544264，EPI544263）HA 和 NA 基因序列作為參比序列進行分析。

2 結果

2.1 2016年-2017年吉安市乙型流感基因亞型分布2016年-2017年吉安市流感監測樣本中乙型流感占一定比例，2016年乙型流感病毒的陽性率超過甲型流感，占 51.3%；2017年有所降低，占29.6%；病毒培養結果顯示本市2016年乙型流感病毒主要為Bv系，占乙型流感病毒培養陽性總數的89.2%，2017年主要為BY系，占該年乙型流感病毒培養陽性總數的71.7%。

表1 2016年-2017年吉安市乙型流感病毒核酸檢測及病毒分離情況

2．2 乙型流感病毒序列測定 選取乙型流感病毒2016年的毒株11株 （6株Victoria系，5株Yamagata系），2017年的毒株 4株（2株 Victoria系，2株Yamagata系）進行HA和NA基因。15株病毒的HA、NA基因擴增產物經純化、雙向測序、序列拼接后，Victoria系B型流感病毒獲得1758bp HA基因序列和1401bp NA基因序列，Yamagata系B型流感病毒獲得1401bp HA基因序列和1041bp NA基因序列，所有毒株序列均未發現核苷酸的丟失和插入。

2．3 HA基因特征分析

2．3．1 核苷酸同源性 8株 Victoria系 B型毒株HA 基因之間的同源性為 99．3%～99．9%，7株 Yamagata系乙型毒株HA基因之間的同源性為98．8%～99．8%。 HA 基因核苷酸進化樹（見圖 1）上顯示，8株Victoria系B型毒株HA基因均為同一分支，且與疫苗株B/Brisbane/60/2008處于同一分支，同源性為 98．7%～99．0%。7株 Yamagata系 B 型毒株 HA基因均為同一分支，與疫苗株B/Phuket/3073/2013處于同一分支，同源性為 99．1%～99．5%。

圖1 HA基因進化樹

2．3．2 與WHO推薦疫苗株在HA1區域氨基酸序列的比較 2016年－2018年 WHO北半球 B型Victoria系流感疫苗推薦株為B/Brisbane/60/2008，本研究的8株Victoria系毒株HA1氨基酸變異較小，與其的差異數為2～3個，分別有1株毒株發生172P＞S、189T＞A 變異，7 株毒株發生 117I＞V 變異、并且全部發生了129N＞D變異，其中117位和129位均位于抗原決定簇上。

與乙型Yamagata系流感疫苗推薦株B/Phuket/3073/2013相比，本研究的7株Victoria系毒株HA1氨基酸變異較小，與其的差異數為1－4個 ， 分 別 為 56D＞N、137L＞I、150I＞V、172L ＞Q、196D＞N、211K＞R、251M＞V、278R＞K， 其中 8 株毒株均在172、251、278位發生了變異。137位和150位位于抗原決定簇上，且該處變異發生于同一毒株（B/JiangxiJizhou/1306/2016）。

2．4 NA 基因特征分析

2．4．1 核苷酸同源性 8株Victoria系乙型毒株NA基因之間的同源性為 99%～99．8%，7株Yamagata系乙型毒株 NA基因之間的同源性為 98．3%～99．9%。NA基因核苷酸進化樹（見圖2）上顯示，8株Victoria系乙型毒株NA基因均為同一分支，且與疫苗株B/Brisbane/60/2008處于同一分支，同源性為 98．7%～99．1%。7 株 Yamagata系乙型毒株 HA基因均為同一分支，與疫苗株B/Phuket/3073/2013處于同一分支，同源性為99%～99．6%。

圖2 NA基因進化樹

2．4．2 NA基因耐藥性位點分析 與乙型流感病毒神經氨酸酶抑制劑敏感株B/JiangxiJizhou/1306/2016相比，本研究的15株毒株NA基因酶催化活性位點 (R－116、D－149、R－150、R－223、E－275、R－292、R－374 和 P－406)氨基酸和輔助位點(E－117、R－154、W－177、S－178、D－197、I－221、E－226、H－273、E－276和 N－294，E－428 位) 氨基酸均未發生替 換 。 對 E105、G108、G141、N144、S249、T325、R374、G407等其他位點進行分析，均未發生氨基酸替換。

3 討論

乙型流感病毒1940年在美國的一次流感中首次被檢出，為單股負鏈分節段帶包膜的RNA病毒[3]，1983年以來根據其基因特征和抗原性的不同分成兩大譜系，分別為Yamagata系和Victoria系[4]。2016年－2017年我市監測流感樣病例陽性標本中，乙型流感病毒占居較大比例，且2016年為我市優勢病毒株，2016年－2017年吉安市B型流感病毒分離情況表明，我市人群中流行的乙型流感毒株中 2016年以 Victoria系為優勢，2017年以Yamagata系為優勢。

乙型流感病毒在復制過程中易發生基因變異，通過抗原漂移和抗原轉變方式引起抗原性改變，乙型流感病毒基因組分8個節段編碼11種蛋白，其中RNA4與RNA6分別編碼血凝素（HA）及神經氨酸酶（NA），血凝素（HA）變異最大，乙型流感病毒和甲型一樣都是依靠病毒外膜蛋白，尤其是血凝素的重鏈HA1的變異，改變抗原特性，逃避抗體已有的免疫保護，導致流感流行[5－8]。目前，已知的B型流感病毒HA1蛋白分子的抗原決定簇主要包括了4個區域，分別是：120環 (116～137)、150 環 (141～150)、160 環 (162～170) 和 190 螺旋（197～205），其中 Victoria系的120環還包括了 75和77兩個位點[9]，這些位點氨基酸的改變，會引起病毒抗原性發生改變[10]。本研究的8株Victoria系流感毒株與疫苗株相比在120環上發生了兩處變異，提示我市2016年－2017年Victoria系可能發生了抗原性的改變，有可能會導致疫苗的保護作用減弱，從而導致流感的流行，這與我市2016年Victoria系流行可能存在一定的關系。但一般認為，一個具有流行病學意義的新變種必須具備，在其血凝素重鏈(HA1)區蛋白分子上，至少有4個以上氨基酸發生了替換，而且這4個替換必須分布在兩個以上抗原決定簇區[11]。

神經氨酸酶抑制劑(NAIs)為乙型流感的特效治療藥物，其藥物靶點為神經氨酸酶，因為它不僅在病毒傳播中發揮重要的抑制作用，而且其酶催化活性位點氨基酸以及周圍的輔助氨基酸非常保守。流感病毒神經氨酸酶的8個氨基酸(R－116、D－149、R－150、R－223、E－275、R－292、R－374 和 P－406)作為酶催化活性位點直接作用底物或者作為維持功能的重要因素，而其他11個氨基酸(E－117、R－154、W－177、S－178、D－197、I－221、E－226、H－273、E－276 和 N－294，E－428 位) 作為輔助位點[12]。NA抑制劑作用于酶催化活性位點或輔助位點[13]，可以有效地阻斷流感病毒感染、復制和傳播的過程。目前美國FDA批準的NAIs有Oseltamivir和Zanamivir，我國2002年批準了Oseltamivir在我國注冊，然而隨著NAIs的臨床使用，耐藥株將不可避免的出現。許多研究人員從臨床研究中發現分離自NAIs治療的病人標本的流感病毒出現耐藥位點的突變[14，15]，這些研究都提示B型流感NA的耐藥位點的多樣性和耐藥病毒株越來越多的涌現。

本次研究并未發現我市乙型流感毒株HA基因抗原性發生較大的變異和NA基因耐藥位點的變異，但是乙型流感病毒抗原性和耐藥性監測應予以長期、持續的加強，以期及時在監測中發現有意義的變異，為本市流感的預防和控制提供技術支持。