呼吸機相關(guān)性肺炎患者下呼吸道標(biāo)本檢出的粘質(zhì)沙雷菌β-內(nèi)酰胺酶檢測及同源性分析

陳曉香，許青霞，盛家和

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州450000)

呼吸機相關(guān)性肺炎 (ventilator-associated pneumonia，VAP)是重癥醫(yī)學(xué)科(ICU)機械通氣患者最常見的感染性疾病之一，可導(dǎo)致患者住院時間和ICU留治時間延長，抗菌藥物使用增加，重癥患者病死率增加[1]，因此遏制VAP已成為醫(yī)療機構(gòu)需要迫切解決的問題[2]。目前，常引起呼吸機相關(guān)性肺炎的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等多有文獻論述[1，3]，但粘質(zhì)沙雷菌引起呼吸機相關(guān)性肺炎鮮有報道，故本文連續(xù)多年收集相關(guān)患者下呼吸道標(biāo)本分離的粘質(zhì)沙雷菌，研究其藥物敏感性特征、主要β－內(nèi)酰胺酶的基因型及是否存在粘質(zhì)沙雷菌在患者之間的傳播，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑 全自動細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀為美國BD公司PhoenixTM－100，PCR預(yù)混液、細(xì)菌DNA提取試劑盒、引物合成等來自上海生物工程技術(shù)有限公司，脈沖場凝膠電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio－Rad公司，PCR擴增儀購自美國ABI公司，E－test試紙條購自安圖生物。

1．2 菌株來源及其鑒定和藥敏 2015年3月1日至2017年3月1日，連續(xù)收集我院重癥監(jiān)護病房明確診斷為呼吸機相關(guān)性肺炎患者下呼吸道標(biāo)本分離的粘質(zhì)沙雷菌。下呼吸道標(biāo)本的臨床檢驗方法均嚴(yán)格參照《臨床檢驗操作規(guī)程》[4]和《下呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)操作指南》[5]。呼吸機相關(guān)性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)遵照 《中華醫(yī)學(xué)會重癥醫(yī)學(xué)分會的診療指 南 》 和 規(guī) 范[1，6]。 質(zhì) 控 菌 株 為 大 腸 埃 希 菌ATCC25922、沙門菌H9812。所有粘質(zhì)沙雷菌的鑒定和最小抑菌濃度測定均使用PhoenixTM－100，并用E－TEST條驗證，判讀標(biāo)準(zhǔn)均參考CLSI2016年1 月 M100－S26[7]。

1．3 β－內(nèi)酰胺酶基因型確證實驗 試劑盒提取菌株基因組DNA為模板，引物及擴增條件均參考相關(guān)文獻[8]，詳見表1。其余β內(nèi)酰胺酶基因blaTEM、blaSHV、blaFOX、blaOXA、blaCTX－M－2、blaCTX－M group 8/25、blaMOX、blaDHA、blaCMY1－23、blaACT－1和blaMIR等擴增條件、引物均參考文獻[9]。如擴增陽性，產(chǎn)物直接純化后測序，結(jié)果在GenBank上比對以確定基因型。

1．4 脈沖場凝膠電泳及指紋圖譜聚類分析 菌株在LB肉湯中過夜震蕩，菌液和2%的低熔點膠灌模，然后使用0．8g/L蛋白酶K消化24h，后使用TE洗膠及XbaⅠ37℃酶切過夜，并埋入1%瓊脂糖凝膠電泳，切換時間為2．16－63．8s，電場強度是6V/cm，電場夾角是 120°，電泳時間是 18．5h，最后用溴化乙錠染色紫外燈成像，判讀參考Tenover等人的標(biāo)準(zhǔn)[10]。

2 結(jié)果

2．1 菌株及藥敏 共收集粘質(zhì)沙雷菌67株。藥敏結(jié)果顯示，粘質(zhì)沙雷菌對亞胺培南和美羅培南的敏感率均為100%，其次哌拉西林/他唑巴坦、環(huán)丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、頭孢他啶、復(fù)方新諾明等 的 敏 感 率 分 別 為 97．59% 、96．18% 、93．27% 、85．07%、82．13%，但對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉、頭孢呋辛、呋喃妥因等敏感率均低于50%。其中對頭孢他啶和頭孢噻肟耐藥的10株粘質(zhì)沙雷菌具體耐藥譜見表2。

2．2 β－內(nèi)酰胺酶表型和基因型確證實驗 ESBLs表型實驗證實，此10株粘質(zhì)沙雷菌β－內(nèi)酰胺酶表型均為陽性。擴增顯示，在約561bp處均有清晰條帶，測序比對的結(jié)果顯示，均為CTX－M－14（詳見圖1），DNA 序列一致率均為 100%；1－5、7、10 在約895bp處有清晰條帶，測序證實均為CMY－1（詳見圖2），DNA序列一致率均為100%。其余均為陰性。

圖1 CTX-M-14基因PCR擴增電泳圖（M為Marker）

表1 PCR擴增引物

表2 10株粘質(zhì)沙雷菌的最小抑菌濃度（μg/ml）

2．3 同源性分析 菌株 1、2、5的條帶的差異小于兩條，表明此三株菌具有同源性，菌株3和4具有完全相同的條帶，表明兩株具有同源性，其余菌株均沒有同源性（詳見圖3）。

圖2 CMY-1基因PCR擴增電泳圖（M為Marker）

圖3 Xbal酶切后的脈沖場凝膠電泳圖

3 討論

粘質(zhì)沙雷菌通常存在水和土壤中，被認(rèn)為是院內(nèi)感染的重要病原菌，可引起肺部、血流和泌尿系統(tǒng)感染等，嚴(yán)重的會引起院內(nèi)感染的爆發(fā)，特別是在重癥監(jiān)護病房。從2015年3月1日至2017年3月1日，我院發(fā)生多起呼吸機相關(guān)性肺炎，其下呼吸道標(biāo)本均分離出粘質(zhì)沙雷菌。藥敏情況統(tǒng)計表明，我院下呼吸道分離的粘質(zhì)沙雷菌沒有碳青霉烯類抗生素耐藥株，對三代頭孢菌素、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等都具有較好的敏感率，優(yōu)于2016年CHINET統(tǒng)計的數(shù)據(jù)[11]；但對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉、頭孢呋辛、呋喃妥因等耐藥率較高，此與CHINET數(shù)據(jù)基本一致[11]。

β－內(nèi)酰胺酶的檢測表明，有10株粘質(zhì)沙雷菌對頭孢他啶和頭孢噻肟耐藥，均檢出CTX－M－14型超廣譜β－內(nèi)酰胺酶。CTX－M是一種質(zhì)粒介導(dǎo)的頭孢菌素酶，包含多個快速增長的亞群，具有臨床重要的意義[12]。CTX－M基因在世界各地的不同菌株均有檢出，但不同地區(qū)流行的ESBLs的基因型或亞型有一定差異，如歐洲以CTX－M－1群為主，亞洲國家以 CTX－M－9 群為主[12，13]。 CTX－M－14 是CTX－M－9群的一種，在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細(xì)菌中均有檢出。

除了CTX-M型超廣譜β內(nèi)酰胺酶外，還發(fā)現(xiàn)了有七株細(xì)菌同時產(chǎn)CMY-1型AmpC酶。CMY-1在國內(nèi)極少有文獻報道，僅國外有限的文獻報道多在家禽和寵物分離的粘質(zhì)沙雷菌CMY-1[14]，另有韓國的文獻報道，367株粘質(zhì)沙雷菌中，CMY-1的檢出率為2.5%[15，16]，其他細(xì)菌包括腸桿菌科的細(xì)菌中，極少檢出CMY-1。本文在臨床標(biāo)本中，連續(xù)在多株粘質(zhì)沙雷菌中，發(fā)現(xiàn)CMY-1型AmpC酶基因，其基因周圍序列的特征對于研究CMY-1基因的進化規(guī)律或重組過程有著重要的意義。

同源性分析的結(jié)果顯示，菌株1、2和5具有典型的同源性。追蹤其病歷發(fā)現(xiàn)，此三株細(xì)菌均來自我院ICU病區(qū)三位不同的患者，均為2016年8月份入院，分別接受了膀胱腫瘤切除術(shù)、陰莖癌腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)和直腸癌術(shù)后放療后入住ICU病區(qū)，均為機械通氣后48h出現(xiàn)體溫升高，白細(xì)胞增多等現(xiàn)象，最高體溫至39℃左右，WBC均在20.5×109/L以上，下呼吸道標(biāo)本涂片低倍鏡下每視野WBC大于25個，伴隨大量的革蘭陰性桿菌并吞噬，鑒定為粘質(zhì)沙雷菌。菌株3和4為2016年5月份入院，均為多器官功能衰竭入住ICU病區(qū)，去除呼吸機后4-5h出現(xiàn)感染癥狀，下呼吸道標(biāo)本也分離獲得粘質(zhì)沙雷菌。結(jié)果表明，同時產(chǎn)CMY-1和CTX-M-14的粘質(zhì)沙雷菌1、2和5可能是我院傳播的克隆株，而菌株3和4可能是我院傳播的另一克隆株。追蹤以上克隆株傳播的路徑有待進一步研究。

總之，通過本文的研究發(fā)現(xiàn)，我院引起呼吸機相關(guān)性肺炎的粘質(zhì)沙雷菌對碳青霉烯類、氨基糖苷類和部分抗生素類仍保持較高的敏感性，但少部分菌株可通過攜帶CTX-M型超廣譜β內(nèi)酰胺酶或CMY-1型AmpC酶導(dǎo)致對三代頭孢耐藥；尤為重要的是，部分患者存在院內(nèi)粘質(zhì)沙雷菌克隆傳播的可能，因此合理使用抗生素，做好院內(nèi)多重耐藥菌的防控極其重要。