ADAMTS-12表達與腰椎間盤退變的相關性分析

韋中陽，侯桂紅

(1、安陽市人民醫院骨一科，河南 安陽 455000；2、洛陽正骨醫院（骨科醫院）頸腰痛二科，河南 洛陽 471002)

腰 椎 間 盤 突 出 癥 （Lumbar disc herniation，LDH）是臨床常見的脊柱退行性疾病，椎間盤纖維環破裂后，突入椎管內的髓核、殘留的纖維環覆蓋在后縱韌帶上，壓迫鄰近神經根，誘發一系列的臨床病癥[1]。該疾病的發病機制尚未明確，臨床發現除生物化學因素外還可能存在細胞因子的作用。解聚蛋白酶－12(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 12，ADAMTS－12) 是一類Zn2+依賴的分泌性金屬蛋白酶家族成員，在維持凝血系統穩態、器官生成、炎癥與生育方面具有重要作用，能夠有效分解明膠，降解膠原溶解物，在椎間盤退變過程中發揮重要作用[2]。本研究對腰椎骨折椎間盤與退行腰椎間盤進行組織學觀察，并分析ADAMTS－12在退變腰椎間盤組織中的表達，以進一步探索椎間盤退變的發病機制，報告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2015年2月至2017年2月在我院治療的腰椎間盤突出患者的椎間盤標本54例，納入標準：⑴均經 CT、MRI等檢查確診[3]，其中MRI示TW2髓核信號變低；⑵均在我院行手術髓核切除；⑶患者臨床病理資料保存完整。排除標準：合并有類風濕疾病、系統性紅斑狼瘡等免疫系統疾病。其中男性30例，女性24例；年齡35～69歲，平均年齡（46．28±9．28）歲；椎間盤節段：L3－4 椎間盤突出患者7例，L4－5椎間盤突出患者34例，L5－S1椎間盤突出患者13例。根據術中觀察及北美脊柱協會[4]分類進行分組，其中后外層纖維環破裂 （指突出椎間盤組織完全穿破外層纖維環和后縱韌帶復合物，并進入椎管內）32例，后外層纖維未破裂 （指椎間盤局部突出區域在外層纖維環和后縱韌帶復合物內）22例。同時選取同期在我院治療的腰椎骨折并接受椎體融合術的患者腰椎間盤組織40例（對照組），其中男性25例，女性15例；年齡 37～72 歲，平均年齡（47．04±10．24）歲；椎間盤節段：L3－4椎間盤突出患者5例，L4－5椎間盤突出患者29例，L5－S1椎間盤突出患者6例。

1．2 MRI檢 測 所 有 患 者 采 用 GE 1．5T Signa TwinSpeed with excite雙梯度超導型磁共振掃描儀進行MRI掃描，相控陣頭線圈完成對腰椎間盤的掃描，MRI掃描時以橫軸位為主，矢狀為輔，進行平掃、動態增強與減影成像，層間距為0．5mm，層厚度為5mm。

1．3 HE染色 ⑴標本固定：將采集的髓核組織制作成標本，固定在4%甲醛固定液6～10h。⑵沖洗、脫水、滲透：使用流水沖洗固定液后，采用梯度酒精脫水，二甲苯透明。⑶組織包埋：預熱好的石蠟倒入蠟槽內，將放好的組織自然冷卻，修整蠟塊。⑷裱片：取一清潔載玻片，涂一層蛋白甘油，在水中撈取切好的蠟片，擺正蠟片，放入格盤中，在64℃溫箱中烘干。⑸切片染色：二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，使用自來水沖洗。⑹蘇木精染色：浸泡7min蘇木精染液，染細胞核，自來水沖洗3～5min。⑺1%鹽酸乙醇分化1－5s，自來水沖洗1～3min。⑻弱堿性水溶液返藍30s～1min，自來水沖洗5～10min。⑼伊紅染色：浸泡伊紅染色液1－5s，染細胞質。⑽梯度乙醇脫水、二甲苯透明。⑾中性樹膠封片。

1．4 免疫組化檢測 ⑴脫蠟、水化：切片浸泡二甲苯5min 2次，梯度酒精水化，自來水沖洗，PBS沖洗2次，5min/次。⑵微波熱修復。切片脫蠟至水后，3%H2O2處理10min，蒸餾水洗 2min×3。 將切片放入盛有 0．01M 枸櫞酸鹽緩沖液（pH6．0）的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃～98℃之間并持續10～15min。取出容器，室溫冷卻10～20min。⑶3%H2O2（80%甲醇）滴加切片上，室溫靜置10min。⑷PBS沖洗2～3次。⑸滴加山羊血清封閉液，室溫放置20min后滴加第一抗體，4℃過夜后需在37℃復溫45min。⑹切片上滴加生物素化第二抗體 （IgG）， 室溫放置 20min，PBS沖洗 3次，5min/次。⑺滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（SA/HRP），37℃ 20min，PBS 沖洗 3 次，5min/次。⑻DAB顯色1～3min，在顯微鏡下掌握染色程度。⑼蘇木精復染2min，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10～15min。⑽乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片、鏡檢。

1．5 聚合酶鏈反應 （PCR） 設置上游引物：5'－CAC－TTGACTGGGTTCCTA－3'； 下游引物：5'－CTCATTCCCGTTCCTCT－3'，擴增片段長度為 1096bp。PCR 擴增體系：10×緩沖液 2．5ul，Mg2+1．0ul（25mol/L），Mix dNTP0．5ul （10mmol/L）， 上、 下游引物各0．5ul （20umol/L），Taq DNA 聚合酶 0．25ul，DNA 模板 1．0ul， 加入雙蒸水至 25ul。PCR反應條件為95℃預變性 2min，94℃變性 45s，51℃退火 1min，72℃延伸 1min，循環 35次，72℃延伸 10min，4℃維持終止。采用ABI3100測序儀進行檢測分析。

1．6 結果判斷 ADAMTS－12蛋白在椎間盤髓核組織細胞的胞漿中表達，根據染色強度分為：無著色為－，淺棕黃色為+，棕黃色為++，深棕黃色為+++，其中++～+++為陽性表達，－～+為陰性表達。椎間盤退變在MRI T2加權像上按Pearce分級標準[5]分為5級，等級越高，表明椎間盤退變越嚴重，其中Ⅰ～Ⅱ級為正常椎間盤，Ⅲ～Ⅴ級為退變椎間盤。

1．7 統計學處理 統計分析采用SPSS 19．0軟件，計量資料采用（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。計數資料比較使用χ2檢驗，以P＜0．05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2．1 椎間盤髓核組織HE染色 正常腰椎間盤髓核細胞呈卵圓形，存在不規則的軟骨陷窩，偶可見少量的細胞團及多核巨細胞，見圖1A，退變髓核細胞的胞質呈現空泡狀，出現軟骨細胞的“網巢狀”結構，見圖1B。

圖1 腰椎間盤髓核組織HE染色（×400，A：正常組織；B：退變組織）

2．2 ADAMTS－12蛋白在腰椎間盤髓核組織中的表達 后外層纖維環破裂患者ADAMTS－12蛋白陽性表達率明顯高于后外層纖維環未破裂患者和對照組 （P＜0．05）； 后外層纖維環未破裂患者ADAMTS－12蛋白陽性表達率明顯高于對照組（P＜0．05）。 見表 1 和圖 2。

表1 ADAMTS-12蛋白在腰椎間盤髓核組織中的表達

2．3 ADAMTS－12 mRNA 在腰椎間盤髓核組織中的表達 后外層纖維環破裂患者ADAMTS－12 mRNA 表達為（0．812±0．048），明顯高于后外層纖維環未破裂患者和對照組（P＜0．05）；后外層纖維環未破裂患者 ADAMTS－12 mRNA表達為 (0．521±0．037)，明顯高于對照組（P＜0．05）。見表 2。

表2 ADAMTS-12 mRNA在腰椎間盤髓核組織中的表達

2．4 不同 MRI分級髓核組織 ADAMTS－12 mRNA表達 MRI分級為Ⅴ級組織ADAMTS－12 mRNA表達為（0．901±0．042），明顯高于Ⅲ級和Ⅳ級組織（P＜0．05）； Ⅳ級組織 ADAMTS－12 mRNA 表達為（0．703±0．040），明顯高于Ⅲ級組織（P＜0．05）。 見表3。

表3 不同MRI分級髓核組織ADAMTS-12 mRNA表達

3 討論

正常人體的椎間盤具有彈性大、緩沖沖擊力強的特征，能夠承受較大壓力負荷，但隨著年齡增大或屈伸、擠壓、扭轉等外力作用，椎間盤發生退行性變，誘發纖維環破裂，出現椎間盤病變[6，7]。腰椎間盤突出是臨床骨科常見病，其發病機制較為復雜，不僅僅是形態學上的變化，同時還伴有組織學與生化性質變化，蛋白多糖與水含量減少、膠原類型轉化、降解酶活性升高與炎癥介質大量釋放，這一系列變化最終導致椎間盤源性腰背部疼痛與神經根病變[8，9]。

臨床研究指出，髓核50%成分為聚集蛋白聚糖，ADAMTS－12為這一類解聚蛋白聚糖酶，可以降解髓核組織，抑制軟骨細胞分化，誘發髓核退變[10]。ADAMTS－12在髓核細胞退變衰老過程中發揮重要作用，其水平變化與髓核退變間的關系已成為臨床研究的熱點[11]。

ADAMTS－12是臨床發現的一種解聚蛋白聚糖酶，由血管內皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞等多種細胞分泌合成，分子量為177．5KD[12，13]。 ADAMTS－12 羥基端血小板反應蛋白可結合軟骨寡聚基質蛋白（COMP）表皮生長因子樣功能區，加強纖維連接蛋白、蛋白多糖、膠原蛋白的聯系，發揮穩定軟骨細胞外基質的作用[14，15]。本研究通過椎間盤髓核組織HE染色發現，正常腰椎間盤髓核細胞呈卵圓形，存在不規則的軟骨陷窩，偶可見少量的細胞團及多核巨細胞，退變髓核細胞的胞質呈現空泡狀，出現軟骨細胞的“網巢狀”結構，這些表現佐證了上述分析，同時也提示ADAMTS－12表達增強可作為椎間盤發生退變的重要標志之一。

本研究采用免疫組織化學方法檢測腰椎間盤組織ADAMTS－12與ADAMTS－12 mRNA的表達，結果提示，腰椎間盤髓核組織中ADAMTS－12蛋白陽性表達率為：后外層纖維環破裂＞后外層纖維環未破裂＞對照組，這說明ADAMTS－12的確參與了患者腰椎間盤組織退變的病理過程，臨床應定期檢查腰椎間盤組織中ADAMTS－12水平，并高度重視ADAMTS－12水平升高者，及時對其采取相應的治療措施，改善預后。為進一步明確ADAMTS－12與退行性腰椎間盤組織的關系，本研究觀察ADAMTS－12 mRNA在不同MRI分級髓核組織中的表達為V級＞Ⅳ級＞Ⅲ級，這表明ADAMTS－12不僅參與了腰椎間盤突出的發病過程，其水平隨著腰椎間盤組織退變程度而不斷升高。

綜上所述，退變腰椎間盤組織中ADAMTS－12的表達不同于腰椎骨折椎間盤組織，ADAMTS－12參與了腰椎間盤組織的退變過程，其表達水平與腰椎間盤組織退變程度有一定關系。