梅毒血清固定患者外周血單核細(xì)胞中Toll樣受體2-mRNA的表達(dá)及臨床意義研究

李燕瓊，張智敏

(1、駐馬店市中心醫(yī)院輸血科，河南 駐馬店463000；2、駐馬店市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 駐馬店 463000)

梅毒血清固定[1]是指沒有并發(fā)癥的潛伏梅毒患者，經(jīng)過正規(guī)驅(qū)梅治療和2～3年的隨訪，非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)保持低度陽(yáng)性，但梅毒抗體可以終身陽(yáng)性。梅毒患者的年齡近年來(lái)呈現(xiàn)低齡化趨勢(shì)，新發(fā)病例增加[2]，而非梅毒螺旋體抗體滴度數(shù)值下降至一定程度后即不再繼續(xù)下降而長(zhǎng)期維持在低滴度。對(duì)于梅毒血清固定的早期檢測(cè)診斷，目前臨床上主要使用患者清晨空腹血液進(jìn)行超速離心后進(jìn)行檢測(cè)，臨床診斷率不高且誤診嚴(yán)重[3]，本文采用近年來(lái)最新技術(shù)Toll樣受體2mRNA（TLR2mRNA）對(duì)所需檢測(cè)樣本的外周血單核細(xì)胞診斷技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以期得到預(yù)期效果。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)后結(jié)果證明，最新技術(shù)Toll樣受體2mRNA（TLR2mRNA）對(duì)梅毒血清固定患者的外周血單核細(xì)胞有表達(dá)差異性，且對(duì)相關(guān)血清因子進(jìn)行檢測(cè)后效果顯著，有實(shí)際的臨床意義，且診斷率較高，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1．1 患者一般資料 選取 2016年5月－2017年 5月在我院門診接受觀察/隨訪的梅毒血清固定患者為觀察對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡≥18周歲；⑵確診為梅毒血清固定患者[4]；⑶無(wú)其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴臨床資料不全者；⑵合并免疫功能障礙者。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)共納入研究對(duì)象80例，男 55 例，女 25 例，年齡 20～48 歲，平均 39．78±2．08 歲，病程 1～4 年，平均 2．75±0．63 年，其中病情程度為早期潛伏梅毒者50例，晚期潛伏梅毒者30例；病程≥2年者32例，＜2年者48例；對(duì)照組納入排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18周歲，無(wú)嚴(yán)重疾病者，共納入80例，男52例，女28例，年齡 21～49歲，平均39．80±2．13歲。兩組的年齡和性別等一般資料比較無(wú)差別，具有可比性。

1．2 方法 對(duì)所需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的人群入院后在門診立即完善相關(guān)檢查后，對(duì)照組應(yīng)在相同時(shí)期內(nèi)在我院進(jìn)行體檢的健康成年人，觀察組同期在我院接受隨訪的梅毒血清固定患者。在同時(shí)期相同的條件下對(duì)兩組患者進(jìn)行清晨空腹抽血化驗(yàn)，對(duì)比兩組Toll樣受體2mRNA在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)以及血清中相關(guān)因子的檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)還需比較梅毒血清固定患者之間不同臨床分期間的2mRNA表達(dá)情況。

標(biāo)本處理：取10mL枸椽酸鈉抗凝靜脈血，F(xiàn)icoll法分離外周血PBMC，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞兩遍后以調(diào)整細(xì)胞濃度約為 1．0×106/ml。PBMC懸液取 100μl，置于試管中再依次加入10μLFITC－抗 CD14 單克隆抗體和 10μLPE－抗TLR2單克隆抗體。FITC－mouseIgG2akappa10μL代替PE－抗TLR2單克隆抗體作為同型對(duì)照。充分震蕩混勻后，置4℃條件下避光孵育30min，再利用上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+細(xì)胞中TLR2的平均免疫熒光強(qiáng)度(meanfluorescenceintensity，MFI)及 TLR2+CD14+占CD14+細(xì)胞群的比例。

Toll樣受體2mRNA檢測(cè)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，所需試劑購(gòu)自蘇州露水生物科技有限公司。操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1．3 評(píng)價(jià)指標(biāo) 觀察兩組Toll樣受體2mRNA在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)水平，比較不同臨床特征梅毒患者外周血單核細(xì)胞中Toll樣受體2mRNA表達(dá)情況。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)和計(jì)量資料分別例和均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組Toll樣受體2mRNA在外周血單核細(xì)胞中表達(dá)的比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同臨床特征梅毒患者外周血單核細(xì)胞中Toll樣受體2mRNA表達(dá)情況的比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0．05：差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組Toll樣受體2mRNA在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá) 梅毒血清固定患者外周血單核細(xì)胞中TLR2mRNA 表達(dá)水平低于對(duì)照組 （t=11．205，P＜0．001）。 見表 1。

表1 兩組Toll樣受體2mRNA在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)

2．2 不同臨床特征梅毒患者外周血單核細(xì)胞中Toll樣受體2mRNA表達(dá)的比較 病情程度為晚期潛伏梅毒、病程≥3年的梅毒血清固定患者外周血單核細(xì)胞中TLR2mRNA表達(dá)水平較低，且不同年齡、性別的患者外周血單核細(xì)胞中TLR2mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差別。見表2。

表2 不同臨床特征梅毒患者外周血單核細(xì)胞中Toll樣受體2mRNA表達(dá)的比較

2．3 影響梅毒血清固定患者外周血單核細(xì)胞中TLR2mRNA表達(dá)水平的因素分析 將單因素分析有意義的病情程度和病程等因素作為自變量，以梅毒血清固定患者外周血單核細(xì)胞中TLR2mRNA表達(dá)水平作為因變量，進(jìn)行多重逐步回歸分析。結(jié)果病情程度進(jìn)入回歸方程，說(shuō)明病情程度是影響梅毒血清固定患者外周血單核細(xì)胞中TLR2mRNA表達(dá)水平的因素。

3 討論

梅毒患者病程一般分為兩期，一期特指硬下疳階段，是一個(gè)特別短暫的過程。二期則是出現(xiàn)了梅毒疹等，經(jīng)過治療消退，大部分的患者在早期潛伏梅毒（2年內(nèi)）或者晚期潛伏梅毒（2年后）之間徘徊，針對(duì)此類患者的治療需進(jìn)行隨訪。梅毒血清固定患者一般均處于潛伏階段[4]。在梅毒血清固定患者的外周血單核細(xì)胞中存在著Toll樣受體2mRNA（TLR2mRNA）。

其中 Toll樣受體 （Toll-likereceptors，TLR）是參與人體第一道防御系統(tǒng)的一類重要蛋白質(zhì)分子之一，也是連接梅毒血清固定患者體液免疫和細(xì)胞免疫的重要受體[5]。Toll樣受體可以識(shí)別來(lái)源于梅毒血清固定患者的外周血單核細(xì)胞中具有保守結(jié)構(gòu)的分子[6]。當(dāng)外周血單核細(xì)胞突破機(jī)體的物理屏障，Toll樣受體可以識(shí)別它們并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答[7]。Toll樣受體能結(jié)合梅毒血清固定患者的外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生的一些內(nèi)源性分子。免疫佐劑可增強(qiáng)梅毒血清固定患者的非螺旋抗體的染色識(shí)別[8]。

由于梅毒血清固定患者在發(fā)生發(fā)展過程中可以產(chǎn)生一些能被Toll樣受體識(shí)別的非螺旋抗體內(nèi)源性配體，所以本研究中Toll樣受體在梅毒血清固定患者應(yīng)答中發(fā)揮了一定作用[9]。在本研究中梅毒血清固定患者監(jiān)測(cè)到2mRNA于Toll樣受體，具有一定的特異性[10]，其中2mRNA是梅毒血清固定患者的非螺旋抗體，通過RNA復(fù)制生成新的RNA后再經(jīng)rRNA進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后生成mRNA，此過程形成于傳遞性RNA轉(zhuǎn)錄后[11]，在梅毒血清固定患者的外周血單核細(xì)胞中具有高度的基因表達(dá)性。因此在本研究中通過對(duì)梅毒血清固定患者的外周血單核細(xì)胞中的Toll樣受體2mRNA的表達(dá)可以有效的檢測(cè)[12]。

在本研究中需要對(duì)表達(dá)后血清中的相關(guān)因子進(jìn)行檢測(cè)即IL-6和TNF-α。IL-6是機(jī)體炎癥因子之一，也是一種重要的內(nèi)源性致熱源[13]。IL-6的血清水平與梅毒血清固定患者中的非螺旋抗體所引起的滴度不變性有關(guān)[14]。TNF-α是一種基因多顯性多肽調(diào)節(jié)因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等。有研究認(rèn)為，TNF-α的改變可能與梅毒血清固定患者的外周血單核細(xì)胞中的Toll樣受體2mRNA的表達(dá)有關(guān)[15]。

本研究中表1顯示梅毒血清固定患者外周血單核細(xì)胞中的基因表達(dá)較低，說(shuō)明這種基因表達(dá)與梅毒血清固定患者的非螺旋體抗體的滴度不變存在相關(guān)性。表2顯示，梅毒血清固定患者的血清檢測(cè)因子呈現(xiàn)率較低，說(shuō)明在梅毒血清固定患者外周血單核細(xì)胞中的炎癥因子成分存在低密度性以上兩種表現(xiàn)形式均有助于診斷。表3顯示梅毒血清固定患者分時(shí)期表達(dá)基因呈現(xiàn)多樣性，說(shuō)明對(duì)于Toll樣受體的2mRNA表達(dá)存在時(shí)期的不均衡性，在確定時(shí)期內(nèi)檢測(cè)效果明顯。表4顯示Toll樣受體的活性受到多種因素的影響，說(shuō)明Toll樣受體在梅毒血清固定患者外周血單核細(xì)胞中的基因表達(dá)中靈敏度高且特異性強(qiáng)。

綜上所述，本研究應(yīng)用梅毒血清固定患者外周血單核細(xì)胞中Toll樣受體2mRNA （TLR2mR鄄NA）的表達(dá)能夠?qū)γ范狙骞潭ɑ颊叩臋z測(cè)效果得到確定且應(yīng)用血清相關(guān)因子的檢測(cè)使本研究效果更具有應(yīng)用價(jià)值，安全可靠，檢測(cè)效果使患者較為滿意，值得臨床推廣應(yīng)用。