胸腔積液中巨噬細胞細胞因子的表達

王瑩，楊軍平，楊小軍，肖亮，梁華

(江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

檢測胸腔積液的方法多種多樣，但各有局限性，例如臨床比較常用、最簡單、最特異的方法—胸水脫落細胞學檢查，陽性率比較低，只有約為30%[1－3]。這是由于在細胞學診斷中經常會遇到不典型的細胞形態(tài)，難以鑒別其來源及性質。而目前有很多的學者采用生物學免疫標記物檢測方法來彌補細胞學診斷中的盲區(qū)，提高判斷胸腔積液性質的準確性。本研究中我們采用酶聯(lián)免疫檢測IL－6、TNF－α、IL－13、TGF－β1 及 RT－PCR 技術檢測 IL－6、TNF－α、Arg－1 mRNA 相結合的方法研究巨噬細胞因子在不同性質胸腔積液細胞中的表達差異，同時結合臨床病史資料，進一步探討其臨床診療價值。

1 資料和方法

1．1 一般資料 所有患者均為2016年5月至2017年12月期間在我院呼吸科住院治療的70例胸腔積液患者，其中良性胸腔積液患者39例，男性26例，女性13例，平均年齡52歲，均經過胸水脫落細胞學檢查、PPD試驗、痰找抗酸桿菌、細菌培養(yǎng)或臨床診斷性治療等方法明確診斷。39例中膿胸伴胸腔積液21例，低蛋白血癥伴胸腔積液7例，心功能衰竭伴胸腔積液5例，肺炎旁性胸腔積液3例，胰腺炎2例，寄生蟲感染1例。另外惡性胸腔積液患者31例，男性21例，女性10例，平均年齡56歲，均經胸部CT檢查、胸水脫落細胞學檢查、支氣管鏡檢查和活檢、淋巴結活檢、胸膜活檢或腫塊穿刺等方法診斷為惡性胸腔積液。其中肺癌25例，乳腺癌伴胸膜轉移和食道癌伴胸膜轉移各2例，惡性胸膜間皮瘤1例，惡性淋巴瘤1例。經過統(tǒng)計學分析，兩組患者性別、年齡比較無顯著性差異 （P＞0．05）。標本處理步驟：取新鮮胸腔積液200ml加入 3．8%肝素抗凝管中，以 2500r/min，離心15min，收集沉淀后置于－80℃冰箱內保存；取新鮮胸腔積液20ml，進行積液常規(guī)檢測、積液生化分析及積液CEA檢測，同時患者采血檢測血清CEA。

1．2 方法

1．2．1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測 取胸腔積液患者血液，立即分離血清，進行IL－6、TNF－α、IL－13、TGF－β1 細胞因子進行檢測。IL－6、TNF－α、IL－13、TGF－β1 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒均購于深圳晶美生物工程有限公司，全部操作嚴格按說明書進行。

1．2．2 RT－PCR 檢測 IL－6、TNF－α、Arg－1 mRNA 表達水平 按照實驗步驟，取－80℃冰箱保存的胸水沉淀細胞，用Trizol試劑提取RNA，按照試劑盒說明逆轉錄cDNA。引物序列；IL－6：正向引物5'－CCACTGCCTTCCCTACTTCA －3'； 反 向 引 物 5'－ACAGTGCATCATCGCTGTTC－3'；TNF－α： 正向引物 5'－GCCAATGGCATGGATCTCAA－3'；反向引物5'－CCCTTGAAGAGAACCTGGGA－3'；Arg－1： 正向引物 5'－ACCCTGACCTATGCGTCATT－3'；反向引物 5'－ATTCCCAGAGCTGGTTGTCA －3'；GAPDH：正向引物 5'－GCTACACTGAGGACCAGGTT－3'；反向引物 5'－CCCAGCATCAAAGGTGGAAG－3'。 PCR反應條件循環(huán)擴增，測定相對含量。

1．3 統(tǒng)計學處理 實驗結果輸入SAS 9．0統(tǒng)計軟件分析，表達水平比較采用t檢驗，P＜0．05為差異有顯著性。相關分析用直線相關分析法（先對數據作對數轉換后作Pearson相關性分析）。

2 結果

2．1 不同性質胸腔積液患者血清 IL－6、TNF－α、IL－13、TGF－β1表達水平 見表 1。

2．2 不同性質胸腔積液中 IL－6、TNF－α、Arg－1 mRNA表達水平 見表2。

2．3 積 液 CEA 與 胸 腔 積 液 TNF－α、IL－6、Arg－1mRNA及血清CEA相關性分析 胸腔積液TNF－α、IL－6、Arg－1mRNA 的表達與血清癌胚抗原、胸腔積液癌胚抗原的表達呈現(xiàn)不同的正相關性 (r=0．399，P＜0．05；r=0．498，P＜0．01；r=0．547，P＜0．01)。見表3。

表 1 各組 IL-6、TNF-α、IL-13、TGF-β1 表達水平（±s）

表 1 各組 IL-6、TNF-α、IL-13、TGF-β1 表達水平（±s）

注：與良性積液組比較，#P＜0．01，*P＜0．05。

組別 n良性積液組惡性積液組t 39 31 IL－6 TNF－α IL－13 TGF－β1 26．98±2．76 87．09±10．47#45．88 30．09±3．01 95．09±46．97#11．46 28．56±3．12 17．96±2．18*－23．04 37．52±10．70 220．52±30．41#46．16

表 2 各組 IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表達量（±s）

表 2 各組 IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表達量（±s）

注：與良性積液組比較，#P＜0．01。

65．18±89．2 135．66±199．7#組別良性積液組惡性積液組n IL－6 39 31 31．89±12．11 155．4±86．4#TNF－α Arg－1mRNA 49．57±12．61 81．3±43．2#

表3 積液CEA與胸腔積液TNF-α、IL-6、Arg-1mRNA及血清CEA相關性分析

3 討論

引起胸膜腔積液的原因很多，但是從細胞免疫的角度來說，是因為激活的免疫細胞聚集在病變部位，這些免疫細胞產生多種細胞因子，有效地發(fā)揮局部細胞免疫作用。IL－6是單核巨噬細胞與T細胞產生的促炎因子，IL－13是活化T細胞產生的抗炎因子，TNF－α是活化的巨噬細胞產生的前炎癥因子，TGF－β1具有雙面效應，正常表達時抑制炎癥反應，過度表達時發(fā)生炎癥性病理變化，綜上所知，這些細胞因子都是參與炎癥反應的[4－6]。本研究結果表明：惡性胸腔積液中患者血清IL－6、TGF－β1、TNF－α含量均升高，說明胸腔局部合成的 IL－6、TNF－α、TGF－β1 增多，是導致胸膜組織病理學改變、引起胸腔積液滲出的主要原因之一。IL－6是基質細胞和免疫系統(tǒng)細胞產生的多效細胞因子，其在機體發(fā)生炎癥反應、免疫調節(jié)與機體防御中起到重要的作用。IL－6是公認的促炎細胞因子，體液中IL－6的水平反映了局部炎癥反應的強度。惡性胸腔積液中IL－6含量增加的原因可能是由于癌細胞分泌的細胞因子，通過自分泌環(huán)路或旁分泌環(huán)路調節(jié)腫瘤細胞的免疫活性，導致局部強烈的炎癥反應，從而誘導IL－6的形成與產生。TNF－α是重要的炎性介質，由活化的巨噬細胞與T淋巴細胞產生的雙效炎癥因子，TNF－α通過損傷內皮細胞，使血管損傷，導致癌癥組織的局部血流受阻斷而引起出血、缺氧壞死現(xiàn)象。TGF－β1是具有多種功能的蛋白小分子多肽，是TGF－β家族的一員。它在細胞的生長、分化、免疫調節(jié)、炎癥、胚胎發(fā)育和組織修復等方面發(fā)揮重要的作用，TGF－β1在腫瘤細胞中可誘導血管內皮生長因子的表達，通過調節(jié)成纖維細胞，產生胞外基質蛋白和細胞粘附蛋白，降低胞外基質的降解酶的生成，增加抑制降解酶的蛋白生成，從而調節(jié)胞外基質的粘附性，并通過增加蛋白水解酶活性啟動與細胞粘附分子的結合，促進腫瘤的侵襲和轉移。TGF－β1表達增高見于腫瘤性疾病如宮頸癌、肝癌，有研究證實在肺癌組織和血清中 TGF－β1 存在高表達[7－9]。 TGF－β1對腫瘤的直接影響一般是通過Smads依賴途徑或者干擾Smads依賴途徑的介導來完成[10]，且其高表達與預后密切相關。有文獻報道，細胞因子在釋放入血的同時，貯存在腫瘤組織的周圍及因腫瘤導致的胸腹水中，惡性腫瘤也在胸膜轉移，胸膜通透性增加。TGF－β1釋放入胸腔積液中。本文顯示，在惡性胸膜炎中TGF－β1的表達升高，惡性胸腔積液TGF－β1含量與良性積液組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），原因可能在炎癥反應初期，TGF－β1招募和激活損傷部位的各種細胞，促使TGF－β1在局部不斷增加。有報道，支氣管灌洗液中TGF－β1高表達的原因，與癌癥病變的分期密切相關[11]，文獻報道[12]惡性積液中的TGF－β1表達明顯高于膿胸和漏出液，我們的結果與文獻報道的基本一致。精氨酸酶(arginase，Arg)是一種參與尿酸循環(huán)的酶，有研究發(fā)現(xiàn)Arg－1在肝組織內高表達，在胸腔組織中也表達[13]。近年來有研究報道Arg－1是一種非常敏感的胸腔細胞腫瘤標記物，但報道結果差異性大。Fujiwara 和 McKnight[14，15]等研究發(fā)現(xiàn) Arg－1陽性率分別為81%和84．4%，略低于我們的實驗結果，可能與我們所采用的方法和判斷標準不一樣有關。我們研究結果發(fā)現(xiàn)Arg－1在惡性胸腔積液中的表達明顯高于良性胸腔積液，結果提示Arg－1是一種比較敏感的判斷胸腔積液細胞性質來源的標記物。