歷史因素對土壤微生物群落與外來細菌入侵間關系的影響

馬 超,龔 鑫,郜紅建,吳 婧,李大明,陳小云,李輝信,劉滿強,*

1 南京農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院,南京 210095 2 農田生態(tài)保育與污染防控安徽省重點實驗室,安徽農業(yè)大學資源與環(huán)境學院,合肥 230036 3 江西省紅壤研究所, 南昌 331717

鑒于對指導生態(tài)保護實踐和驗證生態(tài)學經典理論發(fā)展均有重要作用,土著生物群落特征對外來種入侵的影響(即群落可入侵性)一直都是入侵生態(tài)學的研究熱點[1- 3]。保護和基礎生態(tài)學家曾分別根據群落可入侵性研究成果明確優(yōu)先保護的生態(tài)區(qū)域和探究生物群落構建的機理[4- 5]。但當前群落可入侵性和群落特征間關系的報道卻存在諸多分歧,既有認為物種多樣性會增加群落穩(wěn)定性的生物多樣性阻抗假說[1],也有與之對立的反多樣性阻抗假說——生物多樣性高的群落反而更易被入侵[6]。鄭景明和馬克平[7]提出研究尺度不同是造成上述分歧的主要原因：局域尺度上的生物入侵過程由生物相互作用主導,生物多樣性高的群落空余生態(tài)位少,因而外來種入侵和本地物種多樣性呈負相關[8]；區(qū)域尺度上環(huán)境篩控制外來種的入侵,生物多樣性高則意味著資源多樣性化程度高、生態(tài)位類型豐富,因而外來入侵種表現與土著生物多樣性成正比[9]。但現有關于土壤微域尺度生物群落特征對群落可入侵性影響的研究卻比較少。

前人研究指出,調控生物入侵的關鍵因素在入侵的不同階段可能會存在差異,從而使外來物種在入侵狀態(tài)在不同階段表現異同[10-13]。例如,Nawrot等[12]研究得出雙殼類動物在紅海地區(qū)的入侵到達和建立分別由環(huán)境篩和生物相互作用主導；Ricciardi和Cohen[13]調查發(fā)現外來物種在新棲息地的定殖能力與其對土著群落的危害程度無關。但不論外來種入侵處于何種階段,影響生物入侵的關鍵因素為何,均不可能會影響被入侵地初始生物群落特征[14]。因此,土著生物群落特征和群落可入侵性之間的關系也會因入侵階段改變而變化。此外,由于群落形成實際上是由生物相互作用和環(huán)境篩選共同調控的[15],且群落的組成和結構與其經歷的歷史過程密切相關[16]。由此一個群落當下的特征不僅會反映系統的歷史生物因素狀況,還可能反映系統的歷史非生物因素的影響[17],甚至全由歷史非生物因素決定[18]。這意味著即使外來種入侵過程由生物相互作用主導,但如果群落的生物多樣性本身是由系統歷史非生物因素控制的,那么它最終也可能不會阻抗外來種的入侵(即不符合生物多樣性阻抗假說)。所以,歷史影響因素不同也會引起土著群落特征和外來種入侵之間關系出現差異。綜上可知,探明土壤微域尺度不同入侵階段的外來種狀況與土著群落特征之間關系,及其隨土著群落特征決定因素變化狀況尤為迫切。

本研究擬借助江西紅壤研究所布設于1981年的長期施肥定位試驗,選擇長期化肥和有機肥處理作用下的土壤,并通過將土壤滅菌并回接已方和對方的土壤懸液重新構建土壤系統,從而探究重建土壤系統生物群落特征與系統歷史影響因素以及外源青枯菌接入重建土壤后存活狀況之間的關系,實現明確歷史因素對土壤微生物群落特征與外來細菌入侵潛力間關系的影響及機制的目標。具體研究假說包括：1) 不同土壤微生物群落特征對歷史生物因素和非生物因素作用的響應不同；2) 在任何入侵階段,外來細菌入侵潛力僅和與其受相同歷史因素影響的生物群落特征相關,而與其受不同歷史因素影響的生物群落特征無關。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤分別采自江西省紅壤研究所(28°15′30′E和116°20′24′′N)紅壤性水稻土長期定位試驗田的化肥(每季作物施 N 90 kg/hm2、P2O545 kg/hm2、K2O 75 kg/hm2)和有機肥(早稻施22500 kg/hm2紫云英、晚稻施 22500 kg/hm2豬糞)施肥處理,土壤類型為美國制土壤分類中的強淋溶土和鐵鋁土[19]。從每處理的三個重復小區(qū)采集耕層土壤(0—15 cm),混合后進行大中型土壤動物及根茬等殘體剔除、過篩(5 mm)和冷藏(4℃),基本理化性質如表1。供試外來菌株為紅色熒光蛋白標記的青枯菌RalstoniasolanacearumQL-Rs1115-RFP(R.solanacearum),由南京農業(yè)大學江蘇省有機固體廢棄物利用重點實驗室提供,RFP (紅色熒光蛋白)標記后的菌株除了具Gmr(慶大霉素抗性)外,其余性狀同母株[20]。

表1 初始土壤的基本理化性質

表中數字為平均值, *、**和***分別代表P<0.05,<0.01和0.001,a因為兩組數據的標準差均為0,故無法進行t檢驗

1.2 試驗設計

采用交叉互換設計以便區(qū)分土壤歷史生物和非生物因素的作用[18,21],設置4個處理(圖1)：1)化肥處理滅菌土壤+化肥處理土壤微生物群落(CsCm)；2)化肥處理滅菌土壤+有機肥處理微生物群落(CsOm)；3) 有機肥處理滅菌土壤+化肥處理微生物群落(OsCm)；4)有機肥處理滅菌土壤+有機肥處理土壤微生物群落(OsOm)。試驗過程中進行5次破壞性采樣,每次每處理取3個重復。

圖1 兩種施肥處理土壤生物和非生物因素交叉互換操作示意圖Fig.1 The schematic diagram of reciprocal transplanted soil biotic and abiotic factors after sterilized two different fertilization soilCC和OO：初始化肥處理和有機肥處理土壤,initial soil of chemical fertilizer and organic fertilizer treatment；Cm,Cs,Os,和Om：化肥處理土壤微生物群落,化肥處理滅菌土壤,有機肥處理土壤微生物群落和有機肥處理滅菌土壤,soil microbial inoculum and sterilized soil of chemical fertilizer treatment, as well as soil microbial inoculum and sterilized soil of organic fertilizer treatment；CsCm,CsOm,OsCm,和OsOm：化肥處理滅菌土壤+化肥處理土壤微生物群落,化肥處理滅菌土壤+有機肥處理微生物群落,有機肥處理滅菌土壤+化肥處理微生物群落以及有機肥處理滅菌土壤+有機肥處理土壤微生物群落處理,microbial inoculum from organic amended soils was introduced into sterilized soils with either chemical or organic groups, as well as the microbial inoculum from chemically fertilized soils was introduced into sterilized soils with either chemical or organic groups

根據試驗設計對兩種肥力土壤進行滅菌并回接已方和對方生物群落處理。首先,稱取100.0 g經γ-射線(50 KGy)輻射滅菌的兩種施肥處理土壤,分別放入250 mL帶蓋的玻璃瓶中。其次,稱取未滅菌土壤60.0 g,加入盛180 mL無菌水和若干玻璃珠的三角燒瓶中并振搖30 min,制成土壤生物接種懸液。最后,將裝有滅菌土壤的玻璃瓶等分成兩份后,分別均勻滴加已方和對方的土壤懸液3 mL即可。重建完成后,將60個玻璃瓶一同放在25℃黑暗下培養(yǎng)180 d (使所構建系統穩(wěn)定)再接種外來菌。接種外來細菌前,隨機破壞性取不同處理土壤各3份進行土壤微生物群落分析。

R.solanacearum接種前需在含30 μg/mL慶大霉素的50 mL LB培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)(220 r/min,30℃)。將培養(yǎng)至指數生長期的細菌用無菌水離心(8000 g, 5 min)重懸3次后稀釋成108CFU/mL的菌液。分別移取3 mL稀釋過的R.solanacearum菌液至前述置換處理后的土壤系統中,使最終接種量達107CFU/g干土。25℃黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)56天,于接種后第7、14、28天和56天進行破壞性采樣。

1.3 指標測定

土壤原生動物數量采用最大或然率法進行計數[22]。土壤微生物磷脂脂肪酸分析參照Frostegard等[23]方法進行。土壤細菌物種組成采用末端限制性片段長度多態(tài)性技術(T-RLFP)進行測定,土壤總DNA提取使用FastDNA? SPIN Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals, Solon, OH, USA),16S rRNA基因擴增引物為：5′端帶熒光物質FAM標記的27f (6-FAM- 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)和引物1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′),限制性內切酶HhaI,MspI和RSaI,并以T-RFs的相對組成計算物種多樣性[24]。土壤細菌代謝指紋分析通過Biolog-Eco板(Biolog, Hay-ward, CA, USA)培養(yǎng)測定實現,由于供試土壤微生物碳源利用效率在72 h時最高,因而以該時的試驗結果計算功能多樣性[25]。土壤微生物呼吸、土壤有機碳和總氮等的測定分別采用室內密閉培養(yǎng)法、高溫外熱重鉻酸鉀氧化-容量法和開氏消煮法[26]。

1.4 數據分析

數據分析前分別利用Kolmogorov-Smirnov和Levene方法檢驗數據的正態(tài)分布及方差齊性,并在必要時進行轉換。采用t檢驗分析土壤滅菌和交換接種前后土壤各微生物群落特征的差異。采用兩因素方差分析探究滅菌土壤環(huán)境和接種土壤微生物群落單獨和交互作用對重建土壤微生物群落特征以及外來細菌在其中存活的影響。冗于分析被用于揭示外來細菌存活量或存活時間與土壤各微生物群落特征的關系。線性回歸分析進一步定量調查各土壤微生物群落特征與外來細菌存活狀況的關系。數據統計和圖形制作分別在R 3.4.3和Origin 9.0上完成。

2 結果和分析

2.1 滅菌土壤環(huán)境和接種生物群落對重建土壤微生物群落的影響

重建土壤的微生物呼吸速率、細菌物種和功能多樣性主要受滅菌后土壤環(huán)境因素影響(表2)。僅接種生物群落不同時,重建土壤的微生物呼吸速率、細菌物種多樣性和功能多樣性均無差異(P>0.05)；當接種生物群落同為有機肥處理,相比接入化肥處理的滅菌土壤,接入有機肥的滅菌土壤微生物呼吸速率、細菌物種多樣性和功能多樣性分別顯著下降了29.5%,9.1%和6.5% (P<0.05) (表2)。

重建土壤的原生動物數量、革蘭氏陰性與陽性細菌比(G/G+)主要受接種土壤生物群落來源的影響(表2)。在接種生物群落來源相同而土壤環(huán)境不同時,原生動物數量和G/G+均無差異(P>0.05)；當滅菌土壤同為化肥處理,與接種化肥處理的生物群落相比,接種有機肥處理土壤微生物群落后,重建土壤原生動物數量和G/G+分別顯著下降和上升了17.7%和22.2% (P<0.05) (表2)。重建后土壤的真菌生物量不受滅菌后土壤環(huán)境和接種生物群落來源的影響(P>0.05) (表2)。

表2滅菌土壤環(huán)境和接種生物群落對重建穩(wěn)定后土壤生物群落特征的影響的方差分析

Table2SummaryofANOVAresultsfortheeffectsofsterilizedsoilandmicrobialinoculumonthecommunitycharacteristicsofreconstructedsoil

指標Indices平均值和標準差Mean ± s.e. under each treatment方差分析F- and P-value from two-way ANOVACsCmCsOmOsCmOsOm SESMSE× SM微生物呼吸Microbial respiration/(mg kg-1 d-1)6.75±0.27 9.35±099B10.02±1.52 13.22±1.66A6.25?4.130.05原生動物數量Protozoan/(log 個/g)11.28±0.29a9.28±0.21b11.20±0.48 9.77±0.050.3524.37??0.66真菌生物量Fungi biomass/(nmol/g)2.08±0.45 1.81±0.24 1.14±0.16 1.61±0.17 3.111.001.35革蘭氏陰陽細菌比Gram-/Gram+0.63±0.02b0.81±0.04a0.74±0.06 0.86±0.07 2.026.32?0.30細菌物種多樣性Bacterial species diversity2.07±0.06 2.02±0.07B2.29±0.10 2.24±0.01A8.25?0.410.00細菌功能多樣性Bacterial functional diversity 2.84±0.07 2.89±0.04B2.91±0.09 3.10±0.01A4.20?2.820.88

t檢驗被用于分析土壤滅菌和交換接種前后土壤各微生物群落特征的差異,小寫字母表示同一施肥處理土壤滅菌后接種不同施肥影響下的土壤生物群落時t差異顯著,大寫字母表示不同施肥處理土壤滅菌后接種相同處理土壤生物群落時t差異顯著,不同字母表示差異達到顯著水平(P< 0.05)。兩因素方差分析被用于探究滅菌土壤環(huán)境和接種土壤微生物群落單獨和交互作用對重建土壤微生物群落特征的影響,*和**代表P< 0.05和P< 0.01;SE：滅菌土壤環(huán)境,sterilized soil；SM：接種微生物群落,soil microbial inoculum

2.2 滅菌土壤環(huán)境和接種生物群落對外來細菌存活的影響

R.solanacearum進入重建土壤后56天的存活量受主要微生物群落影響(F=10.78,P<0.05) (圖2)。滅菌化肥處理土壤接種有機肥處理的土壤生物較接種自身生物會顯著促進R.solanacearum的存活；滅菌有肥土壤接種化肥處理生物群落呈相反的趨勢(圖2)。與存活量不同,R.solanacearum的存活時間卻是由滅菌土壤環(huán)境決定的(F=2.35,P<0.01) (圖2)。不論是接種有機肥還是化肥處理的生物群落,滅菌有機肥處理土壤中外來R.solanacearum的存活時間始終顯著高于滅菌化肥處理土壤的(圖2)。

圖2 不同滅菌土壤環(huán)境和微生物群落組合土壤中外來細菌的存活量和總存活時間 Fig.2 Abundance and time needed to reach detection limit (ttd) of R. solanacearum after inoculating into different reconstructed soils 圖中展示了兩因素方差分析的F值和P值以及單因素方差分析和Duncan檢驗結果

2.3 土著微生物群落特征與外來細菌存活的關系

冗于分析顯示,不同土壤生物群落特征與R.solanacearum在土壤中存活量或存活時間的關系存在顯著差異(圖3)。其中,R.solanacearum在56天的存活量與土壤原生動物數量和G/G+關系較為密切,但R.solanacearum在土壤中存活時間則主要受土壤微生物呼吸速率、細菌物種和功能多樣性影響。

圖3 外來R. solanacearum接入土壤后的存活狀況與土壤生物群落特征關系的冗于分析Fig.3 Redundancy analysis (RDA) of soil microbial community characteristics and the survival of R. solanacearum in soil

回歸分析表明,原生動物數量和G/G+同R.solanacearum在土壤的存活量明顯相關,且前者為負相關、后者為正相關(P<0.05)；而土壤微生物呼吸速率、細菌物種多樣性和功能多樣性則同R.solanacearum的存活時間均呈顯著正相關(P<0.05)；土壤真菌生物量同上述二者均不相關(P>0.05) (圖4)。

圖4 外來菌在土壤中存活狀況與土壤各生物特征之間的關系Fig.4 Relationships between the survival of R. solanacearum in soil and resident soil microbial community characteristics圖中展示了相關性分析的R值和P值

3 討論

重建土壤生物群落的原生動物數量、革蘭氏陰性與陽性細菌比(G/G+)等群落特征主要由歷史生物因素決定,而微生物呼吸速率、細菌物種和功能多樣等則受歷史非生物因素控制(表2),這與Xun等[18]的發(fā)現類似。通過群落構建過程的研究,前人發(fā)現群落的組成和結構是生物和非生物因素共同作用的結果[29]。因而重建土壤系統的微生物群落特征也會反映系統非生物因素狀況。通過生物相互作用和環(huán)境篩選對外來種入侵相對貢獻研究,研究者發(fā)現系統生物群落特征不代表生物相互作用影響的情況[17,30]。例如,Naeem等[17]指出當群落可入侵性被外界環(huán)境因素(如氣候和資源)主導時,生物多樣性和群落可入侵性呈正相關,不能反映土著物種的競爭作用對外來種存活的影響。土壤微生物活性、細菌的物種多樣性和功能多樣性等對土壤資源有效性的響應較為敏感,而重建土壤生物群落的資源有效性又主要受滅菌土壤環(huán)境調控,這使得上述微生物群落特征被滅菌的土壤環(huán)境特征所主導[1-33]。土壤G/G+會隨滅菌土壤環(huán)境變化而出現一定波動,但僅在接種懸液不同時才出現顯著差異。這可能是因為系統中物種的出現與消失需較長的時間才能趨于平衡,雖然8個月的時間跨度對周轉速率較快的微生物群落來說較長,但是從群落整體的組成和結構來說,室內培養(yǎng)過程仍無法改變先前30多年田間管理措施所形成的影響格局[18,29]。例如,長期不同施肥措施不僅可通過調控土壤的養(yǎng)分供應來直接影響土壤微生物群落,還能改變土壤pH、團聚體等理化性狀而對土壤微生物產生間接作用[34]。土壤原生動物多以細菌為食,自然也就會與土壤細菌的物種組成(G/G+)一樣,主要由接種土壤微生物群落所調控[35]。

已有的研究表明,在不同入侵階段,決定外來種入侵成功與否的因素會有所差異[12-13]。與前人研究發(fā)現一致,本研究顯示歷史生物因素主導外來細菌前期進入土壤系統的數量,歷史非生物因素控制外來細菌在土壤中的存活時間(圖2)。Levine等[2]也認為外來物種入侵初期受生物相互的影響強于環(huán)境因素的,而后期則主要受到環(huán)境因素的影響。外來細菌接種后能夠在56天后依然存在,說明環(huán)境過濾作用(如pH)不會是其數量的限制因素。外來細菌進入土壤56天后數量沒有爆增,此時土壤有效資源相對豐富,不會限制外來細菌的發(fā)展；但有限數量和尚未廣泛分布的外來細菌會對捕食和拮抗作用等生物相互作用異常敏感[6-37]。反之,隨著進入土壤系統的時間延長,外來細菌進入對數生長期,其受捕食和拮抗作用的影響會減弱,受土壤有效資源的影響會增強[38]。本研究還發(fā)現,外來細菌進入土壤初期的存活數量與原生動物數量和G/G+相關；而外來細菌在土壤中存活天數與微生物活性、細菌物種多樣性和功能多樣性相關(圖3和圖4)。結合前段所述,外來細菌的入侵狀況是否可通過土壤微生物群落特征預測,依賴于不同入侵階段二者的歷史影響因素是否一致。外來細菌接入土壤初期的入侵潛力會因原生動物數量和革蘭氏陽性菌比例增加而降低。這符合天敵逃逸假說的論斷,因為原生動物和部分革蘭氏陽性菌(如放線菌)可分別通過捕食和分泌殺菌性代謝產物抑制外來細菌的活動[39]。但是Yao等[28]研究卻指出外來細菌進入土壤后所受的阻抗程度會隨革蘭氏陰性菌比例的增加而變強,這或歸因于不同研究所選擇的外來菌種類和性狀是不同的。Yao等[28]研究關注的是大腸桿菌(土壤常見細菌)存活時間和G/G+的關系,而本研究分析的是青枯菌(一種土傳病菌)接入土壤初期的存活量。外來細菌進入土壤后期的入侵潛力與土壤微生物活性、細菌物種和功能多樣性呈正相關。一般認為小尺度上群落可入侵性與生物多樣性會呈反比,且物種多樣性和功能多樣性的表現應有差異[1,10,40]。上述分歧主要是因本研究中細菌物種和功能多樣性以及土壤微生物呼吸均由歷史非生物因素決定,三者反映的均是土壤有效資源狀況而非生物相互作用。

本研究的供試土壤是來自同一長期定位試驗田塊的不同施肥處理,這兩種化肥和有機肥影響的土壤在開展施肥處理前的生物和非生物性狀是相同的。結合供試土壤基本性狀和入侵試驗結果可知,長期不同施肥管理措施能夠顯著改變農田土壤的生物和非生物性狀,改變土壤的可入侵性。例如,有機肥處理土壤中外來細菌的入侵潛力明顯提升。這或歸因于：1)有機肥可利用自身攜帶的微生物直接改變土著微生物群落結構,可能改善外來細菌進入初期的存活狀況；2)有機肥中豐富的有效資源可為外來細菌持續(xù)提供養(yǎng)分延長存活時間,有機肥對土壤理化性質的改善也會進一步促進外來菌的生存[18,27,37]。

4 結論

重建土壤系統的生物群落活性、組成和結構特征反映了歷史生物和非生物因素的遺產效應。外來細菌不論是在入侵土壤前期還是后期,其入侵潛力與生物群落特征相關與否均取決于二者的歷史影響因素是否相同。長期不同施肥措施可通過改變農田土壤性質而實現對群落可入侵性的影響。本研究有助于不僅緩解群落多樣性與可入侵性關系悖論,還能指導有益菌劑田間使用和土傳病害的防控。

致謝：美國Georgia Institute of Technology黎邵鵬博士和Kianpoor Kalkhajeh Yusef博士寫作，特此致謝。