血漿miR?1183在結直腸癌中的表達及臨床意義

劉學娟 徐遠東 祝梓原 吳小兵 黎淑玲 甘海寧 徐學虎

1廣州醫科大學附屬第三醫院胃腸外科（廣州 510150）；2廣東藥科大學附屬第一醫院普外二科（廣州 510080）

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年有約70萬人因結直腸癌致死［1］。中國最新癌癥統計數據指出：我國結直腸癌發病率和病死率在男性中分別居第四和第五位，在女性中分別居第三位和第四位［2］。在臨床上超過50%的患者在初診時已經發生了局部轉移或遠處轉移，錯失最佳診治時機而預后不良。因此，探尋有效的結直腸癌早期診斷或預后監測的分子標記物，對改善患者預后，提高患者生存率具有重要的意義。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類長約18～25 nt的非編碼單鏈小RNA。循環中的miRNA特異性和穩定性較好，被證實在多種腫瘤的診斷、篩查、療效監測及預后判斷中具有重要作用［3-5］。miR?1183定位于7號染色體，其參與腦源性神經營養因子（BDNF）促血管生成功能［6］。在風濕性心臟病繼發肺動脈高壓疾病中具有診斷標記物的潛能［7］。干擾miR?1183與EPCAM基因的功能多態性結合和子宮頸癌、乳腺癌的發生進展相關［8-9］。DELLA 等［10］發現 miR?1183，miR?483?5p等13個標記物聯合可作為晚期直腸癌患者化療療效評價指標。然而miR?1183在結直腸癌中的具體作用尚不清楚。

本研究旨在通過檢測各期結直腸癌患者、上皮內瘤變者和健康體檢者血漿中miR?1183的表達水平，分析其與臨床病理參數之間的相關性，初步探討血漿miR?1183在結直腸癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1病例資料采集2011年1月至2017年5月在廣州醫科大學附屬第三醫院胃腸外科診治的68例結直腸癌患者來源的16例癌與癌旁組織樣本和68例術前外周血樣本。其中男39例，女29例，年齡范圍37～88歲，中位年齡為65歲；0期1例，Ⅰ期7例，Ⅱ期26例，Ⅲ期25例，Ⅳ期9例。納入者均為初發未治，病理診斷為結直腸癌不伴有其他腫瘤或重大疾病。15例上皮內瘤變者和25例健康者外周血分別采集于內鏡中心和體檢中心。從患者手術日開始定期電話隨訪，截止日期是2018年3月21日，隨訪時間為10～86個月；至隨訪結束，33例死亡，30例存活，5例失訪。本研究獲得廣州醫科大學附屬第三醫院倫理委員會批準，樣本提供者均簽署知情同意。

1.2組織和血漿樣本的采集癌和癌旁組織（距腫瘤5 cm以上）樣本采集后立即放于液氮中保存過夜，再保存于-80℃冰箱。EDTA抗凝管采集外周靜脈血4 mL，4℃離心機以3 500 r/min離心10 min，收集上清液至凍存管，置-80℃條件下儲存。

1.3總RNA提取及實時熒光定量PCR檢測組織樣本用Life公司的TRIzol試劑抽提組織總RNA，NanoDrop2000分光光度計檢測RNA樣品質量，當D260/D280為1.8～2.0即可認為已達標。再取2 μL總RNA為模板，用Takara反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，然后根據Takara的PCR試劑盒進行擴增。血漿樣本用miRNeasy Serum/Plasma Kit血漿提取試劑盒提取血漿總RNA，當D260/D280為1.6～1.8，認為RNA質量達到要求。取2 μL總RNA作為模板，按照miScript ll RT Kit反轉錄試劑盒進行反轉，再按照miScript SYBR Green PCR Kit進行擴增（血漿樣本所用試劑盒均購自qiagen）。

miR?1183的引物序列：正向引物為5′?CACTG?TAGGTGATGGTGAGAGTGGCA?3′，反向引物為 5′?CTCAACTGGTGTCGTGGA?3′；組織以U6為內參，正向引物為 5′?CTCGCTTCGGCAGCACA?3′，反向引物為5′?AACGCTTCACGAATTTGCGT?3′，血漿用miR?39?1（Spike?In Control購自 qiagen）作為外參。實驗重復3次，每次設3復孔，采集Ct值，miR?1183的相對表達量用 2-ΔCt法表示，ΔCt=Ct miR?1183?Ct U6/Ct miR?39?1。

1.4統計學方法應用Primer Premier 5.0軟件和SPSS 22.0統計學分析。計量資料用x±s表示；血漿miR?1183的數據偏態分布或方差不齊時，以中位數和四分位數間距表示。癌與癌旁組織差異用配對t檢驗分析，血漿樣本兩組間比較及臨床病理參數相關分析采用Mann?Whitney U檢驗，3組間比較采用Kruskal?Wallis檢驗。用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析血漿miR?1183對結直腸癌的診斷效能。Kaplan?Meier法繪制生存曲線，并進行Log?rank檢驗。COX比例風險回歸模型進行單因素和多因素分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1結直腸癌組織樣本中miR?1183的表達水平實時熒光定量PCR檢測16組配對的結直腸癌組織樣本，發現癌組織中miR?1183的表達水平高于癌旁正常組織（t=3.626，P=0.002 5）（圖 1A）。

2.2結直腸癌患者、上皮內瘤變者和健康對照者血漿樣本中miR?1183的表達水平對25例健康者、15例上皮內瘤變者和68例結直腸癌患者的血漿miR?1183水平進行實時熒光定量PCR檢測。Kruskal?Wallis檢驗分析3組之間血漿 miR?1183的表達差異，結果表明差異具有統計學意義（P＜0.000 1）。Mann?Whitney U檢驗結果顯示，血漿miR?1183的表達水平在腫瘤組高于健康對照組（P＜0.000 1），上皮內瘤變組也高于健康對照組（P=0.000 3），并且結直腸癌組高于上皮內瘤變組（P=0.000 7）（圖 1B）。

圖1 qRT?PCR檢測miR?1183在結直腸癌組織和血漿中的表達水平Fig.1 Detection the expression of miR?1183 in colorectal cancer tissues and plasma by qRT?PCR

2.3血漿miR?1183表達水平與結直腸癌患者臨床病理特征之間的關系Mann?Whitney U檢驗分析68例結直腸癌患者血漿中miR?1183的表達水平與臨床病理參數的相關性，結果顯示結直腸癌患者血漿miR?1183高表達與患者的臨床分期（P=0.001 7）、淋巴結轉移（P=0.001 9）、遠處轉移（P=0.039 1）、CEA表達（P=0.041 1）顯著相關，而與患者年齡、性別、腫瘤位置和分化程度無顯著相關（表1）。

表1 miR?1183在結直腸癌血漿中表達水平與臨床病理參數的相關性Tab.1 Correlation between expression of miR?1183 and clinicopathological parameters

2.4 ROC曲線分析血漿miR?1183對結直腸癌和上皮內瘤變的診斷潛能ROC曲線分析顯示，血漿miR?1183水平鑒別結直腸癌患者和健康人的AUC為0.89，95%CI為0.823 1～0.956 9（P＜ 0.000 1），靈敏度為83.82%，特異度為100%，截斷值為0.057 15；血漿miR?1183水平鑒別上皮內瘤變患者和健康人的AUC為0.845 3，95%CI為0.713 4～ 0.977 3（P=0.000 3），靈敏度為66.67%，特異度為100%，截斷值為0.053 55（圖2）。

圖2 ROC曲線分析血漿miR?1183對結直腸癌和上皮內瘤變的診斷潛能Fig.2 ROC curve analysis of the diagnostic potential of plasma miR?1183 on colorectal cancer and intraepithelial neoplasia

2.5 血漿miR?1183表達與生存期的關系Kaplan?Meier法生存分析顯示，血漿miR?1183高表達患者的總生存期明顯短于低表達者，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。進一步單因素及多因素COX風險回歸模型分析影響結直腸癌患者總生存的因素，發現臨床分期、遠處轉移和血漿miR?1183的表達水平與結直腸癌患者的總生存相關，可作為結直腸癌患者總生存的獨立預后預測因子（均P＜ 0.05）（表2）。

圖3 血漿miR?1183表達與生存期的關系Fig.3 Correlation of plasma miR?1183 expression with survival

表2 影響結直腸癌患者總生存期的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivarable analyses of actors predictive of poor overall survival in colorectal cancer patients

3 討論

結直腸癌的5年生存率在局部侵犯者中可達90%，區域浸潤者中降至68%，伴遠處轉移者已不足10%［11-12］，提示結直腸癌治療的關鍵在于早發現早干預，特別在瘤變階段得到及時診治是提高患者生存預后最有效途徑［13］。做到對結直腸癌高危人群的早發現，及時干預，臨床上尚缺乏更為精準的預警手段或生物指標。

循環miRNA在多種腫瘤中被證實可以輔助腫瘤早期診斷、療效評估、復發監測及預后檢測等，有望轉化為敏感而特異的腫瘤標記物［14-15］。miR?1183在宮頸癌、乳腺癌和晚期直腸癌中差異表達，間接參與腫瘤的進展，其在腫瘤包括結直腸癌中的具體作用仍不清楚。

本研究發現miR?1183在結直腸癌組織和血漿中高表達，并且血漿miR?1183表達量在健康-瘤變-癌的演變過程中有梯度上調趨勢；血漿miR?1183表達量與臨床分期、淋巴結轉移、遠處轉移、CEA表達顯著相關；提示血漿miR?1183具有作為結直腸癌診斷和分期標記物的潛能。ROC曲線分析顯示血漿miR?1183從健康人中篩選上皮內瘤變和結直腸癌患者的價值高，AUC分別為0.845 3和0.89。生存分析顯示結直腸癌血漿miR?1183高表達與生存期短顯著相關，不僅證明其在結直腸癌中具有較高輔助診斷效能，還證實其是一個預后預測的獨立影響因素。綜上，miR?1183高表達與結直腸癌發生發展密切相關，有望成為結直腸癌早期診斷及預后預測的新型標記物。

本研究納入樣本類型豐富，有完整的病理及隨訪資料，不僅考慮到miR?1183在組織和血漿中表達的相關性［16］，更能系統探究miR?1183在結直腸癌中的臨床價值，為課題組進一步大樣本分析其與分期關系，確定閾值范圍奠定基礎。本研究的局限在于納入的患者有限，未能排除個體特征差異對結果可能產生的影響［17］。另外，miR?1183參與結直腸癌發生發展的功能機制有待深入研究。

綜上所述，miR?1183具有作為結直腸癌輔助診斷及預后判斷標記物的潛能。然而，miR?1183作為分子指標應用于臨床，尚需更加深入的研究，本課題組將繼續擴大樣本量，探討其在結直腸癌中可能涉及的功能機制，及其聯合其他miRNA或血清腫瘤標志物預測結直腸癌發生發展的潛能。