RECQL4基因在肺癌組織中表達與預后的關系

張潔 張培先 鄧磊 王以

昆明醫科大學附屬延安醫院（昆明 650051）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一［1］。盡管近年來，手術、化療等治療的技術手段日益完善，但仍有超過60%的肺癌患者是在腫瘤的晚期才被發現［2］。近年來我國在肺癌診斷和輔助治療方面也取得了很大進展，但由于環境和經濟發展等眾多因素的作用，肺癌發病率仍呈逐年上升趨勢，且患者的預后情況非常差，嚴重影響了患者的生活質量［3］。因此，臨床上進一步探索新的、有價值的診斷及預后標志物，對進一步提高我國肺癌的診治和評估能力具有重要意義。

RECQL4是一種ATP依賴的解旋酶，屬于RECQ家族一員。研究發現RECQL4的突變能夠導致神經退行性疾病Rothmund?Thomson綜合癥［4-6］，其主要的功能是參與DNA的復制和雙鏈斷裂的修復［7-8］。眾所周知，腫瘤細胞的特點之一就是高頻率的細胞復制，有文獻報道DNA復制和修復酶參與了腫瘤細胞的惡性增殖和化療耐藥，提示該類分子在腫瘤的發生中可能發揮重要作用［9-12］。然而，目前RECQL4基因在腫瘤中作用和機制研究還未見報道。

本研究采用組織芯片結合免疫組織化學的方法和關聯分析，研究了97例肺癌患者RECQL4表達與病理資料及臨床預后的關系。現報道如下。

1 材料與方法

RECQL4 Forward RECQL4 Reverse β?actin Forward β?actin Reverse 5′?AGTGACGACCAGAGCCAGAC?3′5′?CCTTAGCCCACACCATGAAA?3′5′?CCACGAAACTACCTTCAACTCC?3′5′?GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT?3′

1.1材料本實驗的研究對象是肺癌的手術標本，10例正常組織、30例肺癌以及97例帶有臨床特征資料的肺癌組織樣本均來自我院腫瘤科，其中97例帶有臨床特征資料的肺癌患者于2002年1月至2009年3月接受手術治療的部分肺癌患者。本研究是由我院倫理委員會批準，招募患者均簽署了知情同意書。

本研究中應用的肺癌細胞株A549和LTEP從中國科學院上海細胞庫進行購買，細胞培養于10%胎牛血清（Giboco）的RPMI 1640（Hyclone）和F12K（Invitrogen）培養基，于5%CO2和溫度為37 ℃的細胞孵育箱。

1.2方法

1.2.1RT?PCR與RT?qPCR采用液氮研磨和經典Trizol法提取凍存組織的總RNA，測定OD260/OD280值，逆轉錄為cDNA后儲存在-20℃冰箱待用。RT?PCR產物使用2.5%的瓊脂糖膠進行電泳檢測，RT?qPCR使用伯樂道德CFX型號熒光定量儀器測定，結果分析使用2?ΔΔCT法計算。RECQL4和β?actin基因的引物如下：

1.2.2免疫組化RECQL4抗體購買于Abcam公司（ab155402）。免疫組化操作參考已發表論文［13］。一抗按1∶150稀釋，免疫組化實驗結果通過細胞的染色強度和陽性率的乘積進行表達水平定量：染色陽性率≤5%記為0分，5%到25%記為1分，26%到50%記為2分，51%到75%記為3分，＞76%記為4分；染色強度分為陰性為0分，弱陽性為1分，中陽性為2分，強陽性為3分。根據平均表達值，0～7分的患者判定為低表達組，8～12分的患者判定為高表達組。

1.2.3公共數據庫分析大樣本表達驗證數據分析使用 TCGA數據庫（www.genome?cancer.ucsc.edu/proj/site/hgHeatmap/TCGA Lung cancer（LUNG）gene expression by RNAseq（IlluminaHiSeq）·N=1124）。生存期分析使用KM plotter（http：//km?plot.com/analysis）在線數據庫進行分析。分析采用自動選擇最佳劃界值（cutoff）；RECQL4探針為213520_at。

1.3統計學方法本實驗所得數據均采用SPSS 13.0統計軟件處理。當P＜0.05為差異有統計學意義。本研究中采用的統計學方法有：（1）t檢驗；（2）χ2檢驗；（3）Kaplan?meier生存曲線。

2 結果

2.1RECQL4基因在肺癌組織中的表達情況RT?PCR結果顯示，肺癌組織中RECQL4的表達高于正常肺組織的表達水平（圖1A）。RT?qPCR結果表明，RECQL4在肺癌組織中的表達（2.891±0.081 1）也顯著高于正常肺組織（1.431±0.210 3，P＜0.001）（圖1B）。筆者使用TCGA數據庫分析發現，上述結果在大樣本肺癌病人中得到了驗證（圖1C）。進一步采用免疫組化方法在蛋白水平進行檢測發現，RECQL4蛋白在肺癌組織中的表達高于在癌旁組織的表達（圖2）。這些結果說明，RECQL4基因在肺癌組織中的表達明顯高于正常或癌旁組織，提示其可能參與肺癌的發生和發展。

2.2RECQL4表達與肺癌患者臨床參數關系分析為了研究RECQL4表達與肺癌患者臨床參數的關系，本研究通過免疫組化分析了含有97例肺癌患者的組織芯片中RECQL4的表達。通過染色強度和陽性率進行定量RECQL4表達后，與肺癌患者性別、年齡、臨床分期、淋巴結轉移和腫瘤大小進行了關聯分析，結果顯示，RECQL4表達與肺癌患者的臨床分期（P=0.011），淋巴結轉移（P=0.026）和腫瘤大小（P=0.037）顯著相關，而與患者的年齡（P=0.429）和性別（P=0.279）不相關（表1）。

2.3RECQL4表達與肺癌患者預后關系分析為探究RECQL4表達與肺癌患者預后的關系，筆者使用公共數據庫KM plotter分析了RECQL4表達對患者預后的影響，結果顯示對于肺癌患者總生存期，RECQL4高表達是一個不良的預后指標（P＜0.001，n=1145，圖3A）。為了分析RECQL4表達在肺腺癌和肺鱗癌患者預后中的意義是否存在差別，我們使用公共數據庫KM plotter將肺腺癌和肺鱗癌分開后分別進行了分析，結果發現，RECQL4表達在肺腺癌患者總生存期（P＜0.001，n=673）中是一個不利因素（圖3B）。而在肺鱗癌中REC?QL4表達對患者總生存期并沒有影響（P=0.24，n=271，圖3C）。提示RECQL4表達在肺腺癌是一個不利預后因素。

圖1 RECQL4基因在肺癌（T）和正常組織（N）中mRNA水平表達Fig.1 The mRNA expression status of RECQL4 in Lung cancer（T）and normal tissues（N）

圖2 通過免疫組化分析RECQL4蛋白在肺癌和相應癌旁組織中的表達Fig.2 The expression of RECQL4 gene in lung cancer and adjacent tumor tissues detected by IHC

2.4 RECQL4基因在肺癌中功能的初步研究為了確定RECQL4基因在肺癌中是否具有功能，本研究在肺癌細胞株中對該基因表達進行干擾（轉染用siRNA購自Santa Cruz公司，sc?38219），通過MTS實驗檢測干擾RECQL4基因表達后對腫瘤細胞生長及增殖的影響，結果發現干擾RECQL4基因表達后，腫瘤細胞生長和增殖受到了明顯的抑制作用（圖4A～C）。這一實驗結果表明，RECQL4基因具有顯著的腫瘤生長促進功能，是一個潛在的癌基因。

表1 在97例肺腺癌組織中RECQL4表達與病人臨床特征之間的關系Tab.1 The relationship between RECQL4 expression and clinical characteristics in 97 adenocarcinoma patients 例

圖3 RECQL4基因表達與肺癌病人總生存期之間的關系Fig.3 The relationship between RECQL4 expression and Overall Survival（OS）of Lung cancer patients.

圖4 通過MTS實驗分析RECQL4基因對A549和LTEP腫瘤細胞增殖的影響Fig.4 MTS assay was used to examine the effect of RECQL4 on proliferation of A549 and LTEP cells

3 討論

在腫瘤細胞中DNA高頻的復制需要大量參與復制的酶，同時復制產生的錯配也需要大量修復酶進行及時修復［14-15］。RECQL4作為一種ATP依賴的解旋酶主要參與了DNA的復制和雙鏈斷裂的修復［7-8］，這意味著RECQL4在腫瘤形成過程中可能具有非常重要的作用。我們的研究結果顯示，相對于正常或癌旁肺組織RECQL4在肺癌組織中的表達明顯升高，提示RECQL4在肺癌的發生、發展中可能具有極其重要的功能。

為探究RECQL4對肺癌患者的臨床意義，我們分析了97例肺癌患者RECQL4表達與臨床參數的關系。結果發現，RECQL4表達與肺癌患者的臨床分期，淋巴結轉移和腫瘤大小顯著相關。RECQL4在臨床晚期（Ⅲ+Ⅳ，46.51%，20/43）中的高表達比例明顯高于在臨床早期（Ⅰ+Ⅱ，22.22%，12/54）中的高表達比例，而且淋巴結轉移為陽性和腫瘤越大時RECQL4高表達比例越高（表1）。這些結果預示RECQL4在肺癌中很可能是一個癌基因，且可能與腫瘤生長和轉移密切相關。進一步進行初步功能分析發現，RECQL4基因能夠顯著促進腫瘤細胞的生長和增殖。下一步我們將對RECQL4基因是否影響腫瘤的轉移進行功能性研究。

細胞的增殖能力主要取決于兩個主要事件：細胞凋亡和細胞周期。本研究中發現RECQL4能夠明顯加速腫瘤細胞的增殖，那就意味著腫瘤細胞凋亡的減少或細胞周期的加快，抑或兩者兼有。RECQL4是一個DNA螺旋酶，主要影響基因組的穩定性和完整性，參與DNA的復制和雙鏈斷裂。綜合以上，RECQL4影響腫瘤細胞增殖很可能與存在DNA復制及斷裂的細胞周期相關。因此，我們的下一步研究的焦點是確定RECQL4加速腫瘤細胞增殖的主要原因（主要影響細胞周期還是細胞凋亡），以及可能的下游分子和信號級聯通路。

通過進一步分析RECQL4表達與肺癌患者預后的關系發現，RECQL4低表達的患者預后情況顯著優于高表達患者。這一結果暗示，RECQL4可以作為準確預測病人預后的一個潛在標記物。為了確定RECQL4的預后意義在肺癌的兩個主要類型即肺腺癌和肺鱗癌患者中是否存在不同，我們通過數據庫將肺腺癌和肺鱗癌患者分開分別進行預后分析發現，RECQL4表達與肺腺癌患者的預后關系密切，而與肺鱗癌患者預后不相關。前期已有報道發現，SOX30在肺腺癌和肺鱗癌中預后意義存在不同，而且這種不同是由于該基因在兩類肺癌類型中的功能存在明顯差異［16］。那么，RECQL4表達在肺腺癌和肺鱗癌中的不同預后意義是否也存在功能上的不同目前還不得而知，還需要以后進一步的深入研究。

本研究的創新之處是在肺癌中發現了一個新的特異性預后評估指標和功能基因，該結果對肺癌尤其是肺腺癌患者的準確預后評估具有重要的指導意義，并為進一步明確肺癌的發病機制奠定理論基礎。

本研究的不足之處在于肺癌樣本量不足，以至于缺少肺鱗癌患者中RECQL4表達與臨床特征資料之間的關系分析。我們下一步將進一步擴大樣本量，并增加除肺腺癌和肺鱗癌外的其他肺癌類型患者如小細胞肺癌等的樣本，探究RECQL4表達在其他類型肺癌患者中的臨床和預后意義，并分析不同類型肺癌患者中RECQL4臨床和預后意義是否存在不同。進一步探索RECQL4基因在不同類型肺癌中是否存在功能及具體分子機制的不同。

綜上所述，本研究結果顯示，在肺癌中REC?QL4的表達顯著高于正常或癌旁組織，且其表達與患者的臨床分期，淋巴結轉移和腫瘤大小有關密切。初步功能分析發現，RECQL4基因能夠明顯促進腫瘤細胞的生長和增殖，是一個重要候選癌基因。預后分析發現，RECQL4低表達肺腺癌患者預后顯著優于高表達肺腺癌患者，顯示RECQL4是一個有潛在的具臨床應用價值的生物標志物。而且，RECQL4表達只在肺腺癌患者總生存期中是一個不利因素，而在肺鱗癌中與患者生存沒有關系。