七鰓鰻屬3種類的親緣關系分析

常玉梅，黃晶，孫博，蘇寶鋒，梁利群

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所,中國水產科學研究院特殊生境魚類種質特性與抗逆育種重點實驗室,農業部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室,淡水魚類育種國家地方聯合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

七鰓鰻（Lamprey）是現存的古老無頜類脊椎動物的代表種，是脊椎動物演化發育生物學研究的重要模式動物。全球有3科（七鰓鰻科Petromyzonidae、地蝗科Geotriidae和水螨科Mordaciidae），10屬，超過40種。其中4種隸屬于南半球的地蝗科和水螨科，而其余種都屬于北半球的七鰓鰻科[1,2]。

七鰓鰻屬Lethenteron隸屬于七鰓鰻科，主要分布在歐亞大陸[3]。基于形態特征和分子數據，目前大多數學者認為該屬至少有6個有效種：包括一個洄游寄生種北極七鰓鰻（Lethenteron camtschaticum,以前為Lampetra japonica）、兩個淡水非寄生種溪七鰓鰻（Le.kessleri，以前為 Lampetra japonica kessleri和 Le.reissneri,以前為 Lampetra reissneri）[4,5]、兩個日本學者發現的隱秘種Lethenteron sp.N和Lethenteron sp.S[6]，以及一個朝鮮七鰓鰻（Le.morii，以前為 Lampetra morii&Eudontomyzon morii）[2,7]。但近期有學者發現，兩個淡水溪七鰓鰻在表型、核DNA及mtDNA高度相似，將二者歸為同一種Le.reissneri complex[6,8]。最新研究表明，這兩個淡水溪七鰓鰻與北極七鰓鰻又無明顯的種間差異，將其視為北極七鰓鰻的兩種生態類型[8,9]。因此看出，七鰓鰻屬雖被認定為一個有效屬，但是其種類的歸屬仍存在分歧。

線粒體細胞色素c氧化酶亞基I（cytochrome coxidase subunit I,COI）在種間的遺傳變異顯著大于種內的遺傳變異，即使兩個親緣關系非常相近的物種，COI基因的差異也會超過2%[10,11]，是物種鑒定的有效基因。如筆者利用COI基因分析了綏芬河珠星三塊魚（southern forms ofTribolodon hakonensis）和日本珠星三塊魚（northern forms of Tribolodon hakonensis）的親緣關系，發現二者之間遺傳距離大于2%，表明這兩個群體已出現明顯分化，不能視為同一種[12]。

本研究通過分析七鰓鰻屬種屬分類存有爭議的3個種，北極七鰓鰻、溪七鰓鰻及朝鮮七鰓鰻的COI基因，以明確這3個種的分類地位，為更好地保護和利用這些優良的種質資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共用到102尾樣本，各樣本的采集國別、地點、GenBank登錄號及出處見表1。樣品來源如下：（1）本研究在黑龍江撫遠采集北極七鰓鰻46尾鰭條于95%乙醇中保存；（2）從NCBI GenBank數據庫中下載來自俄羅斯26個采樣點（包括黑龍江、薩哈林島、國后島、堪察加半島、北冰洋、西伯利亞南部、烏特霍洛克河和克拉維耶姆河）及美國阿拉斯加育空河的北極七鰓鰻COI序列36條；（3）從NCBI GenBank數據庫中下載來自俄羅斯烏特霍洛克河、克拉維耶姆河和米斯蒙特河的溪七鰓鰻Le.reissneri complex COI序列 17 條；（4）從 NCBI Gen-Bank數據庫中下載來自中國遼寧丹東和黑龍江撫遠的朝鮮七鰓鰻線粒體全基因組序列3條。

1.2 基因組DNA的提取

剪取少量95%乙醇保存的鰭條，濾紙吸干乙醇，放入2mL離心管中加入600μLDNA裂解液（成分：1mol/LTrispH8.0、5MNaCl、0.5mol/LEDTApH8.0、10%SDS和200μg/mL蛋白酶K）于55℃過夜消化，次日加入等體積的酚/氯仿混合液（1∶1）抽提1次，12 000r/min室溫離心10min，吸取上清（～550μL）加入1mL無水乙醇沉淀，12 000r/min室溫離心10min，70%乙醇洗滌1次，室溫干燥10min，加入0.1×TE溶解。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，Nanodrop 8000（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）測定 DNA 濃度，稀釋至 10ng/μL，4℃保存備用。

表1 3種七鰓鰻樣本來源信息Tab.1 Samples information of three lamprey species

1.3 COI基因的引物來源及PCR擴增

線粒體COI引物參照Prasanna等[16]報道的通用引物（COI-F：5′-TCAACCAACCACAAAGACATTG GCAC-3′；COI-R：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAA GAATCA-3′）。PCR 反應總體積體系為 25μL，其中包含自制 PCR buffer mix18μL（包括 50mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl、0.10%Triton X-100、1.5mmol/L MgCl2、0.10%NP-40、0.01%明膠、200μmol/L 4 種 dNTP），濃度10μmol/L的上、下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶 0.2μL（Fermentas，5U/L），模板 DNA 2μL，去離子滅菌水補至總體積25μL。反應程序為95℃預變性 3min，35 個循環包括 95℃15s、57.7℃30s、72℃30s，最后72℃延伸7min。PCR擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至北京諾賽基因公司進行測序。

1.4 序列處理及分析

將測序得到的序列文件用DNASTAR.Lasergene 7.1中的EditSeq模塊轉換成fasta格式用于后續分析。采用ClustalX1.83對COI基因序列進行多重比對，獲得對齊后的同源序列,采用NCBI網站提供的Bankit提交到GenBank數據庫中。利用DNAsp 5.10.01鑒定單倍型；使用MEGA7.0計算所得單倍型的堿基組成、單倍型間的替換率和轉換/顛換R值。將從NCBI GenBank數據庫中下載的56條已知COI序列和mtDNA全基因組序列（北極七鰓鰻36條、溪七鰓鰻17條和朝鮮七鰓鰻3條）與本研究得到的46條序列合并后采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建基于Kimura雙參數模型（Kimura 2-parameter,K2P）的單倍型進化樹，并經1 000次自展檢驗（Bootstrap），選用黃鱔 Monopterus albus COI基因相應片段（GenBank登錄號：MF122533）作為系統進化分析的外類群；用MEGA7.0計算基于K2P模型下各個類群內部的遺傳距離及各類群間的平均遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 單倍型分析

序列經比對處理后得到COI有效序列長度為451bp。102條有效序列共檢測到16種單倍型（圖1）。北極七鰓鰻共檢測到14種單倍型，其中中國群體有4種單倍型（GenBank登錄號：MH638349～MH638352），俄羅斯群體多樣性較高，有11種單倍型，美國群體有3種單倍型，大部分個體共享2種單倍型Hap1和Hap5；溪七鰓鰻有3種單倍型，均與北極七鰓鰻共享；朝鮮七鰓鰻獨享2種單倍型，分布在兩個不同的地理群體（遼寧丹東和黑龍江撫遠）（表2）。單倍型堿基組成分析顯示，A、T、C、G 4種堿基所占比例恒定，平均含量分別為27.7%、30.3%、28%和14%，A+T含量（58%）明顯高于C+G含量（42%）。平均堿基替換率為19.03，堿基交換/顛換R值為3.19。

2.2 單倍型序列分歧度分析

圖1 COI基因在3種七鰓鰻群體中的16種單倍型Fig.1 Sixteen haplotypes of COI gene found in three lamprey species

表2 COI基因的16種單倍型在3種七鰓鰻群體中的分布Tab.2 Distribution of 16 haplotypes of COI gene in threelamprey species

16種單倍型間的序列分歧度計算結果見表3。由表3可知，北極七鰓鰻14種單倍型間的序列分歧度為0.002～0.011，其中中國群體4種單倍型間的序列分歧度只有0.002～0.004，俄羅斯群體11種單倍型間的分歧度為0.002～0.011，美國群體3種單倍型分歧度為0.002～0.007；溪七鰓鰻和北極七鰓鰻共享3種單倍型，序列分歧也只有0.002～0.004；朝鮮七鰓鰻獨享2種單倍型，Hap9和Hap16，序列分歧度達到0.020。遼寧丹東群體單倍型Hap9與北極七鰓鰻和溪七鰓鰻的單倍型序列分歧只有0.002～0.011，而黑龍江撫遠群體單倍型Hap16與北極和溪七鰓鰻的單倍型序列分歧較大，為0.016～0.025。

2.3 3種七鰓鰻的系統進化關系

采用MEGA7.0軟件中的鄰接法構建3種七鰓鰻16種單倍型間的系統發育進化樹（圖2）。由圖2可知，除了朝鮮七鰓鰻黑龍江群體Hap16單獨聚類外，其余15種單倍型無明顯分化，聚為一支。各類群間和類群內平均遺傳距離顯示，北極七鰓鰻和溪七鰓鰻親緣關系較近，而朝鮮七鰓鰻與二者較遠；北極和溪七鰓鰻種內不同群體無明顯分化，而朝鮮七鰓鰻不同群體存在一定分化（表4）。

圖2 七鰓鰻屬魚類COI基因單倍型的系統發育進化NJ樹Fig.2 Neighbour-Joining tree of COI gene in genus Lethenteron

表3 16種單倍型間的序列分歧度Tab.3 Sequence divergenceamong 16 haplotypes

表4 3種七鰓鰻各類群間和各類群內平均遺傳距離Tab.4 Mean genetic distance between and within each group in three lamprey species

3 討論

3.1 北極七鰓鰻和溪七鰓鰻的系統進化關系

北極七鰓鰻主要分布在歐亞大陸的東部、日本列島，朝鮮半島的北部及北美大陸的西北部，有溯河寄生型（anadromous-parasitic form）和河流非寄生型（fluvial-nonparasitic form，也叫定居型）兩種生活史類型[17-19]。然而，一些學者認為這兩種生活史類型的命名和分類也有問題。Yamazaki等[19]利用微衛星標記研究了溯河寄生型、河流定居型和陸封型北極七鰓鰻的群體遺傳結構，結果發現，這些同水域的七鰓鰻能夠一起產卵，而且存在緊密的基因流，推測這種大小不匹配的交配和不同生活史的可塑性是導致不同類型群體基因流產生的重要原因[20]；隨后Artamonova等[8]利用COI基因分析俄羅斯北極七鰓鰻洄游型和定居型群體發現，二者具有相同的單倍型，認為不同的生活史類型是由北極七鰓鰻表型的可塑性進化而來。

溪七鰓鰻分布也很廣泛，從歐亞東部河流到日本北部，包括阿納德爾、堪察加半島、鄂霍次克海、黑龍江、薩哈林島和日本北部[6,17]。早期學者根據地理分布和生活史，認為溪七鰓鰻Le.kessleri和Le.reissneri是兩個獨立種[2]。而 Makhrov等[18]分析了來自俄羅斯北部70個河流七鰓鰻的形態、分布、生態、資源量等認為棲息在歐亞大陸北方的七鰓鰻應為北極七鰓鰻的不同生態類型；隨后Artamonova等[9]分析了歐亞大陸七鰓鰻屬COI部分序列單倍型的分布，同樣認為地理分布和生活史均不能成為鑒定這些種類的標準，支持將Le.kessleri和Le.reissneri劃分為北極七鰓鰻的兩種生態型而非兩個獨立種。

分子聚類研究發現，北極七鰓鰻和溪七鰓鰻組成一個單獨的分支，沒有種間差異[6,8]。從本研究的系統聚類也可以看出，來自中國、俄羅斯和美國不同水域的北極七鰓鰻，雖然有14種單倍型，多樣性較高，但種內遺傳距離只有0.002，14種單倍型聚為一支（圖2）。而溪七鰓鰻的3種單倍型均為北極七鰓鰻的主效單倍型（Hap1，Hap5和Hap13），種間遺傳距離最小，只有0.001（表4）。由此推測，溪七鰓鰻起源于北極七鰓鰻，支持二者為同一種的不同生態類型，這與日本和俄羅斯學者的觀點一致。

3.2 朝鮮七鰓鰻的分類地位

朝鮮七鰓鰻主要分布在朝鮮半島的中部和北部河流，我國遼寧和黑龍江也有少量分布[14,15,17]。早期命名為Lampetra morii，后來根據形態特征建議為Eudontomyzon morii[7]，目前根據分子數據歸為Lethenteron屬[2,17]。Goto[21]利用 COI基因重建了東亞地區七鰓鰻屬的系統進化樹，同樣支持朝鮮七鰓鰻是七鰓鰻屬的一個有效種。本研究結果表明，雖然我國遼寧丹東和黑龍江撫遠地區的朝鮮七鰓鰻獨享兩種單倍型，但是只有黑龍江撫遠群體獨享的Hap16與北極七鰓鰻的14種單倍型分歧較大，從0.016～0.025不等，平均0.02，達到不同種的分化水平（～2%），認為朝鮮七鰓鰻黑龍江群體為七鰓鰻屬的一個有效種。而遼寧丹東群體獨享的Hap9與北極七鰓鰻序列分歧較低0.002～0.011，且與黑龍江群體單倍型分歧達到種級分化水平。因此，這種差異是否采樣誤差導致，需待進一步驗證。

綜上所述，本研究分析的七鰓鰻屬的3個種，實際只有兩個有效種，北極七鰓鰻和朝鮮七鰓鰻。其中北極七鰓鰻由于生活環境、大小及表型特征的多樣性存在多種生態類型。