RP/HPLC測定吡蟲啉血藥濃度及其大鼠灌胃藥代動力學評價

龔小見，蘇 敏，趙 超，周 欣*

(1.貴州師范大學 貴州省山地環境信息系統與生態環境保護重點實驗室，貴州 貴陽 550001；2.貴州師范大學 貴州省藥物質量控制及評價技術工程實驗室，貴州 貴陽 550001；3.貴州師范大學 天然藥物質量控制研究中心，貴州 貴陽 550001)

近年來，各類食品安全事件頻發，威脅人們健康和社會穩定。農產品生產過程中農藥的使用會導致其殘留在農作物體內，當農藥富集到一定量后將會影響人體健康[1]。吡蟲啉(Imidacloprid)是20世紀80年代由德國和日本農藥公司共同開發的一種內吸、高效、殘效期長的農用優良新煙堿類殺蟲劑，化學名為1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基咪唑烷-2-亞胺，分子式為C9H10ClN5O2。其化學性質穩定，廣泛用于種子、葉面和土壤中多種害蟲的防治[2-3]。吡蟲啉會使人產生嗜睡、心悸、嘔吐、頭暈和定向障礙，嚴重者導致心率過緩及心肺驟停[4]，并具有基因毒性和免疫毒性等嚴重的毒副作用[5-6]。因此，分析吡蟲啉在動物體內的代謝過程和代謝動力學參數可為合理安全用藥提供科學依據。

目前關于吡蟲啉在果蔬以及土壤中的殘留檢測報道較多，分析方法主要包括高效液相色譜法[7-10]、高效液相色譜-質譜聯用法[11-14]和氣相色譜-質譜聯用法[15]，但對吡蟲啉在動物體內的代謝過程研究較少。本文對SD雄性大鼠灌胃68.1mg·kg-1吡蟲啉(10% LD50值)[16]，采用甲醇直接沉淀蛋白質的方法處理血漿樣品，建立了HPLC測定大鼠血漿中吡蟲啉含量的方法。同時采用藥代動力學軟件(DAS2.0軟件)對吡蟲啉灌胃給藥后大鼠的平均血藥濃度～時間數據進行分析，初步掌握了吡蟲啉在動物體內的變化規律。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DIONEX Ultimate3000型高效液相色譜儀(包括四元泵處理器、自動進樣器、RS柱溫箱、二極管陣列檢測器以及 Chromeleon7.2色譜工作站)，TGL-16M型離心機(長沙邁佳森儀器設備有限公司)，XS105DU型十萬分之一電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，EYELAMG-2200型氮氣吹干儀(日本東京理化器械株式會社)。

吡蟲啉標準品(純度98%，貴州迪大科技有限責任公司)；肝素鈉(貴州迪大科技有限責任公司)，以蒸餾水配制成1000IU/mL；甲醇(色譜純，Tedia公司)；甲醇(分析純，天津科密歐化學試劑有限公司)；生理鹽水(貴州科倫藥業有限公司)；實驗用水為自制蒸餾水。

雄性SD大鼠(長沙市天勤生物有限公司)，體重為150～250g，SPF級，許可證號:SCXK(湘)2015-0011。

1.2 儀器工作條件

色譜柱為Agilent ZORBAX C18柱(4.6mm×250mm，5μm )，流動相為甲醇-水(30∶70)，進樣量20μL，檢測波長245nm，流速1.0mL/min，柱溫為室溫。

1.3 實驗方法

1.3.1對照品溶液的配制精密稱取2.0 mg吡蟲啉標準品，用適量甲醇溶解并定容至10 mL，配成0.2 g/L的儲備液，使用時以甲醇稀釋至所需質量濃度。

1.3.2供試品的制備取100 μL血漿樣品置于1.5 mL離心管中，加入400 μL甲醇，渦旋1.0 min充分混勻，在4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，取上清液于1.5 mL空白離心管中，以40 ℃氮氣吹干，殘留物加入100 μL甲醇，渦旋振蕩混合30 s，4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進樣。空白血漿按上述方法處理。

1.3.3吡蟲啉的代謝動力學試驗隨機選取6只健康雄性SD大鼠，實驗前12 h禁食不禁水，灌胃給藥68.1 mg·kg-1吡蟲啉，在給藥前5 min和給藥后0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、12.0、15.0、18.0、20.0、24.0 h，經眼眶取血0.5 mL，用肝素鈉抗凝的離心管采集血樣，血樣在4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，分離血漿置于空白離心管中，于-80 ℃冰箱儲存備用。

2 結果與討論

2.1 蛋白沉淀劑的選擇

分別考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮作為蛋白沉淀劑的效果，發現丙酮作蛋白沉淀劑時對色譜峰有干擾，且操作繁瑣；乙醇、乙腈為蛋白沉淀劑時的平均回收率低于甲醇，甲醇為蛋白沉淀劑的平均回收率為74.7%，因此選擇甲醇作為蛋白沉淀劑。

2.2 流動相的選擇

考察了甲醇-水和乙腈-水體系為流動相時的分離效果，結果表明，兩種流動相均能將吡蟲啉與基質干擾峰分開。考慮到成本及環保等因素，最終選擇甲醇-水作為流動相，其最優體積比為30∶70。

圖1 空白加標血漿(100 mg·L-1)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the blank spiked(100 mg·L-1) plasma

2.3 方法專屬性

取空白血漿，按照“1.3.2”方法處理，精密取20 μL進樣，得空白血漿的HPLC圖；取空白血漿，精密加入100 μL質量濃度為100 mg·L-1的吡蟲啉對照品，采用上述方法處理，得加標血漿樣品的HPLC圖。由圖可知，血漿中的內源性物質不干擾吡蟲啉的測定，被測物的色譜峰形良好(圖1)。

2.4 線性范圍、檢出限及定量下限

取SD大鼠空白血漿8份，每份100 μL，分別加入標準系列對照品溶液，渦旋1.0 min，按照“1.3.2”方法操作，配成吡蟲啉質量濃度為0.5、2.5、10、20、40、80、100 mg·L-1的標準溶液，精密吸取20 μL進樣分析。以吡蟲啉的質量濃度(X，mg·L-1)為橫坐標，對應峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸。吡蟲啉在0.5～100 mg·L-1范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為Y=0.322 6X-0.228 8(r2=0.999 8)。以目標化合物與其附近基線噪音的比值(S/N)確定檢出限(S/N=3)及定量下限(S/N=10)，得血漿樣品中吡蟲啉的檢出限為10 μg·L-1，定量下限在100 μg·L-1以內。

2.5 提取回收率

精密取SD大鼠空白血漿100 μL，配制吡蟲啉質量濃度為10、15、20 mg·L-1，每個質量濃度樣品各3份，按照“1.3.2”方法處理；同法配制吡蟲啉質量濃度為10、15、20 mg·L-1的對照品溶液，每個質量濃度各3份，過0.45 μm濾膜后取20 μL進樣。以空白加標血漿樣品與標準溶液的色譜峰面積比值計算回收率，得吡蟲啉的平均回收率為74.7%。

2.6 精密度

精密吸取空白血漿100 μL，加入不同質量濃度的吡蟲啉對照品溶液100 μL，分別配制成10、15、20 mg·L-13個水平的質控樣品，按照“1.3.2”方法處理，分別連續進樣3次計算日內相對標準偏差(RSD)；連續測定3 d，計算日間RSD。結果表明，樣品的日內RSD不大于5.4%，日間RSD不大于6.2%，符合生物樣品分析方法指導原則的規定。

2.7 穩定性試驗

配制100 μL質量濃度分別為10、15、20 mg·L-1的吡蟲啉加樣血漿各9份，3份在室溫下放置24 h后按照“1.3.2”方法處理和分析，考察樣品在室溫下的穩定性；3份于-20 ℃冰凍，取出融解，反復凍融3次后同法處理和分析，考察樣品的3次凍融穩定性；3份于-20 ℃冰凍半個月后取出自然解凍，同法處理和分析，考察樣品的長期穩定性。所得結果的RSD為3.7%～9.6%，表明樣品的穩定性較好。

圖2 吡蟲啉的血藥濃度～時間曲線Fig.2 Concentration-time curve of imidacloprid in plasma

2.8 吡蟲啉在大鼠體內的藥代動力學研究

按照“1.3.3”方法取100 μL血漿樣品，采用“1.3.2”方法處理后進行測定。所得結果采用藥代動力學軟件(DAS 2.0版軟件)進行數據處理，繪制動力學曲線(圖2)，藥代動力學參數見表1。

表1 吡蟲啉的藥代動力學參數Table 1 The pharmacokinetic parameters of imidacloprid

結果表明，分布半衰期(t1/2α)小于消除半衰期(t1/2β)，說明吡蟲啉在大鼠體內分布較快，主要以消除為主；達峰時間(tmax)為7.333 h，達峰血藥濃度(Cmax)為23.557 mg/L，藥時曲線下面積(AUC(0-t))為276.727 mg·h/L，表觀分布容積(Vd)為842.796 L/kg，清除率(CL)為137.991 L/(h·kg-1)，這些數據說明吡蟲啉在大鼠體內吸收慢，達峰時間長，血藥濃度高，體內分布廣，消除速率快；K21大于K12，表明吡蟲啉從周邊室向中央室轉運的速率大于從中央室向周邊室轉運的速率，說明吡蟲啉主要分布在血液和血流豐富組織中。綜上所述，吡蟲啉在大鼠體內呈二隔室模型分布，以一級藥代動力學方式消除。

3 結 論

本文建立了測定大鼠血漿中吡蟲啉含量的RP/HPLC方法，該方法前處理簡單、回收率較高、穩定性好、操作簡便，可用于生物樣品中吡蟲啉含量的測定。采用所建立的方法研究了SD大鼠灌胃給藥量為68.1 mg·kg-1(10%LD50)吡蟲啉的藥代動力學行為，測定了不同時間下血漿中吡蟲啉的濃度，并擬合計算了給藥后大鼠體內的藥代動力學參數，為吡蟲啉的合理安全用藥提供了科學依據。