毛花苷C促進肝癌細胞Huh-7凋亡并增強caspase-7的活化

張艷群，徐 慶，曾永聯，羅 琴，鄒海凡，譚 寧

(桂林醫學院1.藥學院、2.廣西肝臟損傷與修復分子醫學重點實驗室、3.科學實驗中心，廣西 桂林 541004)

原發性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，全國每年約有38.3萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡總人數的51%[1]。目前，醫治HCC仍以手術為主，兼物理療法、化學藥物療法等在內的綜合治療。臨床常用的肝癌化療藥物如蒽環類抗瘤藥等，缺乏高度的組織選擇性，在發揮療效的同時，往往產生較嚴重的全身性毒副作用[2]。因此，如何使化療藥物既提高腫瘤化療效果，又減輕化療藥物的毒副作用，已成為腫瘤藥物治療亟待解決的關鍵問題。

強心苷類(Cardiac glycosides，CGS)是一類從植物中提取的類固醇衍生物，能明顯興奮心肌細胞，目前作為心衰和心房顫動的常用治療藥物。自1960年，相繼有研究發現，洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因等強心苷類藥物具有預防和治療腫瘤的作用[3]。Stenkvist等[4]研究表明，乳腺癌患者在使用洋地黃治療后，腫瘤轉變為良性的比例升高，且在乳房切除術5年后，使用洋地黃治療的患者乳腺癌復發率僅為對照組的10.42%。同時，Goldin等[5]在給予127位癌癥患者使用洋地黃治療后，發現21例癌癥死亡中僅有1例屬于洋地黃組。并且CGS能選擇性地抑制腫瘤細胞的增殖，誘導其凋亡，而對正常細胞無明顯影響[6]，因而強心苷類化合物被認為是一類新型的抗癌藥物。為了進一步證實CGS抗腫瘤治療的臨床價值，美國FDA正在進行小規模的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，結果尚未公布。本實驗采用不同濃度的毛花苷C(lanatoside C)溶液干預肝癌Huh-7細胞，研究毛花苷C對其增殖、凋亡及凋亡相關酶caspase-7活化的影響，初步探討毛花苷C對肝癌的抑制作用，為其臨床應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 肝癌Huh-7細胞株購自中科院上海生物科學研究所細胞資源中心。

1.1.2試劑 毛花苷C(上海旭東海普藥業有限公司，CAS：#17575-22-3)，采用嘧啶試劑作溶劑溶解毛花苷C，使其終濃度為20 g·L-1，過濾除菌后，室溫避光存放備用。DMEM高糖培養基(Gibco公司，貨號11885-076)；胎牛血清FBS(Corille公司，C1015-05)；Cell Counting Kit-8試劑(上海同仁化學研究所，CK04)；caspase-7單克隆抗體(12827)購自CST公司；抗β-actin一抗(SC-47778)購自Santa Cruz公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(上海東仁化學科技，AD10)。

1.1.3儀器 Elix3+30L+3YNERGY超純水系統(美國Millipore公司)；311氣套式CO2培養箱(美國Thermo公司)；Infinite M200 pro Nano Quant光柵型連續波長酶標儀(瑞士TECAN公司)；Allegra X-22R冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特公司)；ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；BD FACSAriaⅢ分選型流式細胞儀(美國BD公司)；LSM710激光共聚焦掃描顯微鏡(德國蔡司公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將Huh-7細胞接種于含支原體抗生素的改良DMEM培養基中，培養于37℃、5% CO2培養箱中，胰蛋白酶常規消化傳代，選擇處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2細胞增殖實驗 胰酶室溫常規消化細胞后，用含FBS的DMEM培養基吹打成分布均勻的單細胞懸液，按1×103個/孔接種于96孔板中，培養于37℃、5% CO2培養箱中，細胞貼壁24 h后，加入毛花苷C使其終濃度為0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1，以等體積嘧啶作為對照，同一濃度設置3個復孔，分別培養2 h及1、3、5、7 d后，棄去培養基，每孔加入CCK-8溶液100 μL，繼續培養2 h后，使用酶標儀檢測450 nm波長處吸光值。增殖抑制率/%=(對照組A450值-加藥組A450值)/對照組A450值×100%。

1.2.3克隆形成實驗 胰酶室溫常規消化細胞后，用含FBS的DMEM培養基吹打成分布均勻的單細胞懸液，按1.6×103個/孔接種于6孔板中，繼續培養于恒溫培養箱中。培養10 d后加毛花苷C，使其終濃度為0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1，以等體積嘧啶代替毛花苷C作為對照組，同一濃度設置3個復孔，再繼續培養6 d后棄去上層培養基，PBS輕柔洗板2次，細胞用4%多聚甲醛固定15 min，棄多聚甲醛，結晶紫溶液染色15 min，清水反復浸洗，室溫晾干，采集圖像保存后，每孔加入2 mL 10%的冰醋酸溶液溶解結晶紫，每孔再取100 μL置于96孔板中，使用酶標儀檢測各孔560 nm波長處吸光度值，并按以下公式計算克隆抑制率[7]。克隆抑制率/%=(對照組A560值-加藥組A560值)/對照組A560值×100%。

1.2.4細胞凋亡檢測 取處于對數期的Huh-7細胞，以1×106個細胞接種于培養皿，培養24 h細胞貼壁后，加入毛花苷C，使其終濃度為0.003 2、2 mg·L-1，加等體積嘧啶作為對照組。待毛花苷C作用48 h后，消化細胞，收集細胞懸液并離心，棄上清，D-PBS重懸清洗1次，離心棄上清液，1×Annexin V Binding buffer重懸細胞，并吹打混勻，加入10 μL Annexin V/FITC和10 μL PI染色液(20 mg·L-1),避光染色30 min。300目篩網過濾細胞懸液，使用流式細胞儀測定并采集數據[8]。并通過激光共聚焦顯微鏡采集加入毛花苷C 48 h后，以及相應對照組Annexin V/FITC及PI染色圖像，FITC檢測波長為510～550 nm。

1.2.5Western blot檢測 將Huh-7細胞室溫消化后接種于培養皿中，24 h貼壁后，加入毛花苷C，使其終濃度為0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1，加等體積嘧啶作為對照組，作用48 h后收集細胞，采用RIPA裂解細胞提取細胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度，再在蛋白樣品中加入上樣緩沖液混勻后，95℃金屬浴10 min，冰上放置10 min后，保存于-20℃冰箱備用。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白樣品，轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉(TBST配制)室溫搖床封閉1.5 h，4℃孵育一抗過夜，TBST洗膜5次，每次10 min，室溫孵育二抗1.5 h，TBST洗膜5次，每次5 min，與ECL發光液反應2～3 min后，X線片曝光、顯影、定影，采用Gel-Pro Analyzer圖像分析系統計算分析X線片吸光度值。

2 結果

2.1毛花苷C抑制Huh-7細胞增殖Tab 1的CCK-8實驗結果顯示，在加入毛花苷C后3 d，可發現毛花苷C對Huh-7細胞增殖的抑制作用隨著藥物濃度的增加而明顯增強。加藥5 d時，Huh-7細胞生長抑制率分別為(3.86±1.45)%、(8.64±1.43)%、(14.11±4.87)%、(79.72±2.23)%、(84.27±0.04)%。其中，0.003 2 mg·L-1毛花苷C組與對照組相比，無明顯差異(P>0.05)；0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1毛花苷C組與相應對照組相比，呈現明顯差異(P<0.05)。

2.2毛花苷C抑制Huh-7細胞克隆形成Fig 1的克隆形成實驗結果顯示，毛花苷C對Huh-7細胞克隆形成具有明顯的抑制作用(P<0.05)，隨著毛花苷C濃度增高，Huh-7細胞克隆抑制率隨之增大。0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1的毛花苷C干預Huh-7細胞10 d后，克隆抑制率分別為(3.29±2.84)%、(19.41±2.66)%、(56.08±3.66)%、(69.03±1.81)%、(65.02±1.12)%。其中，0.003 2 mg·L-1毛花苷C組與對照組相比無明顯差異(P>0.05)，0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1毛花苷C組較對照組表現出明顯差異(P<0.05)。

2.3毛花苷C促進Huh-7細胞凋亡取對數生長期的Huh-7細胞，給予不同濃度的毛花苷C培養48 h后，離心收集細胞，以Annexin-V/PI雙重染色后，使用流式細胞儀分析。如Fig 2A、2B所示，2 mg·L-1毛花苷C組與對照組晚期凋亡細胞(Q2)分別為(12.03±1.09)%、(6.97±0.25)%，早期凋亡細胞(Q4)分別為(7.63±0.61)%、(1.50±0.14)%，差異明顯(P<0.01)。通過激光共聚焦顯微鏡觀察(Fig 2C)，發現2 mg·L-1毛花苷C組Annexin-V染色(綠色熒光)高于對照組。

Tab 1 Lanatoside C inhibited hepatocellular Huh-7 cell proliferation

*P<0.05vscontrol

Fig 1 Lanatoside C inhibited hepatocellularA:Different concentrations of lanatoside C inhibited clonal proliferation of Huh-7 cells; B: Comparison of different concentrations of lanatoside C inhibiting Huh-7 cell clonal formation(A560 nm).*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2.4毛花苷C促進Huh-7細胞凋亡蛋白caspase-7的活化不同濃度毛花苷C干預Huh-7細胞48 h后，Fig 3蛋白免疫印跡結果顯示，毛花苷C可以明顯促進Huh-7細胞caspase-7蛋白從35 ku全長蛋白形式，活化為18 ku活性蛋白形式，對照組caspase-7蛋白并未出現明顯活化。

3 討論

2000年，Haux等[9]對9 271例使用洋地黃治療的患者進行分析，雖未發現該化合物具有明顯的抗癌作用，但血藥濃度高能降低患白血病和尿道癌風險，為強心苷的抗癌作用研究提供了基礎，現已有上千篇報道強心苷類化合物體外抗癌特性的論文發表。

強心苷類物質抗癌機制包括抑制Na+/K+-ATP酶活性、抑制缺氧誘導因子1活性、抑制成纖維細胞因子2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)和NFκB、抑制拓撲異構酶的活性、阻斷ER、誘導細胞凋亡等[10]。而化療藥物引起癌細胞死亡的關鍵機制為誘導細胞凋亡，caspase是參與細胞凋亡的主要蛋白酶。Badr等[11]在人惡性膠質瘤細胞研究發現，毛花苷C可激活caspase蛋白的表達，從而誘導其發生凋亡。Caspase最初以酶原存在于細胞中，當起始凋亡蛋白酶如caspase-8、caspase-9通過低聚反應而激活時，進一步激活caspase-3、caspase-6、caspase-7等效應凋亡蛋白酶，從而導致與凋亡表型相關的一系列生物化學及形態學變化[12]。

Caspase可通過外源性途徑及線粒體內源性途徑激活[13]，當FasL與腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)分別與細胞膜上的死亡受體Fas及腫瘤壞死因子受體TNFR發生特異性結合，隨即引發死亡誘導信號復合體(death-inducing signaling complex，DISC)的形成，DISC募集caspase-8，并促進下游的caspase酶原激活。而內源性途徑則是由各種細胞內外應激如癌基因的活化、DNA損傷、細胞缺氧等引起[14]。在內源性凋亡途徑中，激活后線粒體外膜通透性增加，從而使細胞色素C及其他促凋亡因子由線粒體向胞質釋放，這一過程主要受Bcl-2蛋白家族調控。Bcl-2蛋白家族的Bak、Bax等激活后，與線粒體外膜受體結合，在線粒體膜上形成孔道，使線粒體內部一些大分子蛋白如Smac/DIAB-LO、HtrA家族成員Omi/HtrA2以及細胞色素C由孔道釋放到細胞質中，細胞色素 C上存在caspase活化因子1(Apaf-1)特異性結合位點，Apaf-1與之反應后，誘導別構效應而激活[15]，Apaf-1上具有與caspase-9同源的caspase募集與激活結合域(caspase raised and activating domain，CRAD)，活化的Apaf-1能夠以CARD-CARD方式聚集并活化caspase-9，形成由細胞色素C、Apaf-1、caspase-9組成的凋亡小體，該凋亡小體可激活caspase-7，進而誘導下游蛋白的降解，最終引起細胞凋亡。在本實驗中，采用不同濃度的毛花苷C干預肝癌Huh-7細胞，結果顯示，毛花苷C能明顯抑制Huh-7細胞增殖，促進Huh-7細胞凋亡，增強caspase-7的活化水平。提示毛花苷C誘導細胞Huh-7發生凋亡可能與細胞內源性凋亡途徑有關，具體作用機制尚不明確，需要進一步實驗進行證實。

Fig 3 Lanatoside C up-regulated activationof caspase-7 in Huh-7

(致謝：本實驗在桂林醫學院科學實驗中心完成，感謝對本課題研究給予幫助的老師和同學。)