轉基因動物制備方法

華再東 任紅艷 鄭新民

（1動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064；2湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，湖北武漢 430064）

轉基因技術是分子生物學技術的拓展，是現代探索生命科學奧秘的有效工具，是推動人類社會進步的偉大技術。就目前形勢來看，轉基因技術已經滲透到我們生活的各個方面，如疾病治療、疫苗生產、制藥、環境衛生、農作物、食品加工等多個領域，具有很好的經濟價值和社會意義。

就制備歷程來看，動物轉基因技術發展主要經歷了采用顯微注射法及病毒載體法制備轉基因動物和基于體細胞克隆為核心技術制備轉基因家畜。關于動物的轉基因方法，最早是利用胚胎感染反轉錄病毒進行基因的轉移，獲得了世界首例轉基因動物。之后通過顯微操作將外源基因注射到小鼠胚胎，獲得了轉基因小鼠。1982年，Palmiter等[1]將含有大鼠生長激素的結構基因與小鼠的金屬硫-Ⅰ基因啟動子相連，再利用顯微注射技術將融合后的DNA片段注射到小鼠卵的原核中，最后成功制備了著名的“超級小鼠”，加速了動物生長方式的研究，為人類研究遺傳疾病和巨人癥建立了動物模型。在此之后，各國科學家和學者掀開了對轉基因動物研究的序幕，先后在豬、牛、羊等動物身上取得成功。在1997年，Wilmut等[2]通過體細胞核移植獲得克隆羊，動物轉基因技術又進入了新的篇章，為動物生物反應器的發展開拓了新的方向。2017年，世界上首例體細胞克隆猴“中中”誕生[3]。

在制備轉基因動物的過程中，外源基因很容易發生隨機打靶，使得目的基因不表達或低表達，插入正常基因位點影響正常基因表達等，這些因素很大程度上制約了轉基因動物的應用發展。為了提高基因編輯的效率，近年來不斷發展出新的基因編輯技術，如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等技術。以下綜述動物轉基因應用的顯微注射、逆轉錄病毒感染、體細胞核移植、胚胎干細胞介導和精子介導等方法。

圖1 顯微注射制備轉基因小鼠示意圖

1 顯微注射技術

顯微注射技術是指在高倍倒置顯微鏡下，用顯微注射針將外源基因導入胚胎或細胞內的一種方法。隨著受精卵的不斷發育，外源基因被整合到受體基因組中，最后發育成熟為轉基因動物。Gordon等[4]首先采用受精卵原核注射方法，將皰疹病毒基因注射到小鼠原核期胚胎的原核內，獲得了相應的轉基因小鼠（圖1）。此技術的優點是實驗周期較短，且導入的外源DNA大小不受限制。但其實驗要求使用精密儀器且價格昂貴、導入的外源基因拷貝數不受控制等諸多因素也限制了這一技術的使用。盡管如此，考慮到直接作用于基因功能，整合效率較為穩定，所以這項技術目前仍是建立轉基因動物的常用方法。

2 逆轉錄病毒感染法

逆轉錄病毒感染法（retrovirus-mediated gene transfer）是利用逆轉錄病毒的侵染能力，將外源基因整合到宿主基因組中，經重組后制備出轉基因動物。逆轉錄病毒(retrovirus)又名反轉錄病毒，是一組RNA病毒，由于它們在復制過程中必須經過由RNA到DNA這一逆轉錄的過程而得名。其種類有很多，如人類免疫缺陷病毒 （HIV）、rous肉瘤病毒（RSV）、禽白血病病毒（ALV）等。1974年，Janenisch等[5]利用逆轉錄病毒介導法將SV40病毒DNA注入小鼠囊胚腔中，經手術轉移至子宮內發育，獲得轉SV40基因的小鼠，為腫瘤病毒垂直傳播和表達實驗提供了新的研究工具。Bosselman等[6]運用REV病毒作為載體，然后將GH基因導入牛胚胎中，成功制備了轉基因牛。逆轉錄病毒介導法已廣泛運用于轉基因動物的制備，包括人類遺傳疾病的研究、細胞功能缺失校正、遺傳物質表達和產物等研究領域。目前，研究結果表明逆轉錄病毒介導法具有感染效率高、宿主范圍廣等特點。但是慢病毒載體只能攜帶小于10 kb的基因片段，存在致癌的風險，且容易出現嵌合體，因此在實際應用中有一定局限性。

3 體細胞核移植法

體細胞核移植技術先將外源目的基因轉染到體細胞中，使體細胞在體外培養、傳代，篩選出整合有外源目的基因的體細胞作為核移植的供體細胞，然后供體細胞注射到去核卵母細胞間隙，再通過人工激活、融合技術，獲得體外重組胚胎，移植給代孕母畜動物體內，獲得轉基因動物（圖2）。在理論上，出生的個體100%是陽性動物，而且外源基因的表達穩定，可顯著提高生產轉基因動物的效率，降低成本。

2000年，McCreath等[7]應用體細胞克隆生產出世界首例轉基因克隆豬，隨后2001年又得到雙基因敲除的的克隆綿羊。近年來發展起來的用于基因打靶的核酸酶包括鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄激活子樣效應因子核酸酶（TALEN）和聚類的規則間隔短回文重復序列（CRISPR/Cas9）系統大大豐富了制備用于核移植的體細胞的手段[8-10]。

圖2轉基因豬制備示意圖

4 胚胎干細胞介導法

此法是在體外將外源基因導入胚胎干細胞，然后利用顯微操作儀將其注入動物囊胚中，參與宿主胚胎發育，最后得到轉基因動物。胚胎干細胞（embryonic stem cells,ES）是將早期胚胎的內細胞團分離出來，進行體外傳代培養，建立的穩定多能細胞系。這些胚胎干細胞通過脂質體轉染、電穿孔或病毒感染等方法將外源基因導入，使ES細胞整合外源基因。利用這些細胞作為核移植的供體細胞，最后通過體細胞克隆技術制備出轉基因動物。對已經分化的體細胞進行重編程，以形成類似胚胎干細胞的誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells），大大簡化了制備轉基因動物的過程。有學者分別利用iPS細胞，通過四倍體囊胚注射得到了存活并具有繁殖能力的小鼠，證明了iPS細胞的全能性[11]。

胚胎干細胞介導法優勢在于胚胎干細胞在植入胚胎之前可體外選擇特殊的基因型，在細胞水平連續傳代、轉染，有利于陽性細胞的篩選。但是到目前為止只有小鼠和人的穩定胚胎干細胞系，在其他大動物上，如豬、牛、馬等物種，還很難獲得穩定的胚胎干細胞系，因此制約了該方法在實踐中的應用。

5 精子介導法

精子介導法（sperm mediated gene transfer）是利用精子頭部能夠捕獲外源基因的特性，把精子與外源基因共孵育，使外源DNA被精子捕獲，然后再形成受精卵，最后制備出轉基因動物。1989年Lavitrano等[12]首次報道把PSV2CAT質粒與小鼠的附睪精子共孵育，得到了陽性克隆小鼠，證明了使用精子作為外源基因的載體制備轉基因動物是可行的，這一研究成果得到了廣泛的關注。Perry等[13]將外源基因和精子頭部混合注入卵母細胞中，獲得的受精卵體外培養，進行胚胎移植，成功獲得了轉基因小鼠。雖然這種方法提高了轉基因動物的生產效率，但是該方法對卵細胞的傷害較大，還未被應用于生產實踐。目前，很多實驗室利用精子載體法獲得了很多不同種類的轉基因動物，如轉基因猴、馬、豬等。與其他轉基因方法相比，該方法操作簡單，使用成本低廉，不需要繁瑣的方法步驟和精密的儀器，進而引起了眾多科研工作者的重視。該方法缺點是在大動物上獲得轉基因個體的陽性率較低，不穩定。

綜上所述，轉基因技術經歷幾十年的發展，日漸成熟，從隨機插入到定點整合，從單一技術到多元手段，科技人員一方面希望通過基因編輯改良動物的遺傳性狀，充分發揮動物的繁殖率、抗病率，以及改善肉類品質等；另一方面也在研究把動物作為生物反應器去獲取人類所需的藥品、優質蛋白和動物模型等，并取得了可喜的研究成果。但是在轉基因技術的研究中還有很多問題，包括生產技術上的難題和生物安全、人類健康、道德倫理等，這些都是現代和未來的科研工作者亟待解決的難題。轉基因技術的應用正在蓬勃發展，目前已經涉及多個領域，未來更有巨大的經濟價值和社會意義。