水解蛇蛻的幾種方法及水解產(chǎn)物的生物活性研究

蔣凱 嚴(yán)發(fā)展 丁秦超 陳鑫珉 梁文星 丁濱

摘 要：目的 比較幾種蛇蛻水解方法的水解效率，并以HaCaT細(xì)胞評(píng)價(jià)水解產(chǎn)物的生物活性。方法 利用乙酸、NaOH、氧化還原兩步法在不同溫度和時(shí)間條件下水解蛇蛻；利用茚三酮法、考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)水解產(chǎn)物中氨基酸及多肽的含量；用HPLC測(cè)定提水解產(chǎn)物分子量；利用HaCaT評(píng)價(jià)水解產(chǎn)物的生物活性。結(jié)果 酸水解的最適條件為80℃、2.5mol/L乙酸反應(yīng)6h；堿水解的最適條件為80℃、0.625mol/L NaOH反應(yīng)6h；氧化還原水解法最適試劑濃度分別為6%過硫酸氫鉀、4mol/L尿素、1.25%亞硫酸氫鈉；通過上述方法獲得的膠原蛋白多肽分子量約為1kDa。該多肽能夠促進(jìn)細(xì)胞體外增殖。

關(guān)鍵詞：蛇蛻；多肽；水解；生物活性

中圖分類號(hào)：R932 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2018）29-0032-03

Abstract： Objective： The hydrolytic efficiency of several snake slough hydrolysis methods was contrastively studied， and bioactivity of the hydrolysate was evaluated with HaCaT. Methods： The snake slough was hydrolyzed by acetic acid， NaOH and two-step redox methods at different temperatures and time. The contents of amino acids and peptides in the hydrolysates were determined by ninhydrin and coomassie brilliant blue methods， respectively. The molecular weight of hydrolyzed products was determined by HPLC. The HaCaT was used to evaluate the biological activity of the hydrolysate. Results： The optimal conditions of acidic or alkalic hydrolysis methods were as follows： 2.5 mol/L acetic acid at 80°C for 6 h， 0. 625 mol/L NaOH at 80°C for 6 h. And the optimum reagents for redox hydrolysis was 6% potassium persulfate， 4 mol/L urea assemble 1.25% sodium bisulfite. The molecular mass of the hydrolysate was about 1 kDa. The hydrolysate could promote the cell proliferation in vitro.

Keywords： snake slough； polypeptide； hydrolysis； biological activity

蛇蛻[1]是游蛇科動(dòng)物的干燥表皮膜，有龍子衣、蛇符、龍衣之稱。性咸、甘、平，入肝、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)、解毒、定驚、退翳的功能，富含無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、膠原蛋白等成分，可通過水解獲得。膠原蛋白因其較好的物理性能和生物學(xué)特性，廣泛用于醫(yī)療器械、食品添加、化妝品生產(chǎn)等領(lǐng)域[2-4]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者就膠原蛋白生物材料的構(gòu)建已開展了大量工作[5-6]，其中主要集中在哺乳動(dòng)物和水生動(dòng)物來(lái)源的膠原蛋白上，而爬行動(dòng)物來(lái)源的膠原蛋白開發(fā)研究尚不完善。本研究比較了幾種不同水解蛇蛻的方法，并初步判斷水解產(chǎn)物的分子量大小，驗(yàn)證了水解產(chǎn)物的生物活性。為蛇蛻水解產(chǎn)物的開發(fā)和應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)及生化試劑均購(gòu)自華東醫(yī)藥（上海）有限公司。蛇蛻經(jīng)過浙江中醫(yī)藥大學(xué)丁志山教授鑒定分別為中華眼鏡蛇（Naja atra）尖吻蝮蛇（Deinagkistrodon acutus）和大王蛇（Elaphe carinata）。

1.2 方法

1.2.1 蛇蛻氨基酸組成的對(duì)比分析。取1g蛇蛻粉，用10mL 6mol/L鹽酸經(jīng)N2除氧密封后置于110℃油浴中水解24h，獲得的水解產(chǎn)物用德國(guó)Sykam全自動(dòng)氨基酸分析儀分析。

1.2.2 蛇蛻水解。堿、酸水解：取蛇蛻按質(zhì)量體積比1：100分別加入不同濃度的NaOH溶液或冰醋酸溶液于4℃、40℃、80℃水浴中水解4天、24h和6h停止水解。以上水解產(chǎn)物置于截留分子量為1000的透析袋中浸泡在pH7的PBS溶液，至樣品pH近中性。氧化還原提?。悍Q取洗凈干燥的蛇蛻浸沒在一定濃度的過氧化氫鉀溶液中，30℃恒溫水浴加熱60min后用蒸餾水洗凈，并浸沒于4%尿素、1% SDS、1.25%亞硫酸氫鈉混合液，40℃恒溫水浴加熱4h，高速離心5min，取上清并調(diào)節(jié)pH至中性，-20℃冷藏。

1.2.3 氨基酸和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。采用茚三酮分光光度計(jì)法測(cè)定氨基酸含量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。

1.2.4 HPLC分析水解產(chǎn)物。分別以乳球蛋白（35kDa）、肌紅蛋白（16.9kDa）、核糖核酸酶A（13.7kDa）、尿苷

（244kDa）等11種蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)品。用Phenomenex提供，型號(hào) BioSep-SEC-s2000，規(guī)格300×7.80mm的柱子，以100mmol/L磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，流速1.0mL/min分析。并以分子量對(duì)數(shù)為y軸，出峰時(shí)間為x軸，制作蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。以上述條件同時(shí)分析蛇蛻水解樣本。

1.2.5 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)。用不同濃度的蛇蛻水解物水溶液在37℃包被細(xì)胞培養(yǎng)板2h，棄去上清液后，用生理鹽水潤(rùn)洗兩次。將105個(gè)/mL HaCaT細(xì)胞轉(zhuǎn)接入已包被好的培養(yǎng)板內(nèi)，24小時(shí)之后計(jì)數(shù)各組細(xì)胞數(shù)，用試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性。

2 結(jié)果

2.1 蛇蛻中常見氨基酸組成

對(duì)比三種蛇蛻中常見氨基酸的含量，發(fā)現(xiàn)僅組氨酸含量存在差異，其中尖吻蝮蛇蛇蛻中組氨酸含量最高超過1%，中華眼鏡蛇含量最低僅為0.662%。

2.2 酸解、堿解效率比對(duì)實(shí)驗(yàn)

蛇蛻體積大、質(zhì)量輕，在本研究中采用1：100質(zhì)量體積比，分別用不同乙酸、NaOH在不同溫度下水解不同時(shí)間。水解結(jié)束后對(duì)比分析不同條件水解產(chǎn)物中氨基酸（表1）和蛋白質(zhì)（圖1）的含量。

2.3 氧化還原水解效率對(duì)比實(shí)驗(yàn)

分別用1%、2%、4%、6%和8%的過硫酸氫鉀溶液水解蛇蛻60min后的殘?jiān)谜麴s水洗凈，再用1M尿素和1.25M亞硫酸氫鈉混合液繼續(xù)水解，稱重計(jì)算水解效率分別為50.2±2.82%、53.8±2.33%、71.7±2.64%、86.9±0.71%和53.8±1.23%。以水解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量計(jì)算得水解效率分別為0.42±0.019、0.45±0.017、0.57±0.011、0.73±0.009、0.44±0.012g/g蛇蛻。

2.4 水解產(chǎn)物分子量

HPLC分析11種已知分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，相同條件下分析2.5M乙酸（圖2A）和氧化還原二步法（圖2B）處理的蛇蛻水解物。HPLC分析顯示，酸水解和氧化還原二步法水解得到的多肽保留時(shí)間為11.70min，根據(jù)校準(zhǔn)曲線判斷該多肽分子量為1kDa。

2.5 蛇蛻水解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

蛇蛻水解液包被的96孔板培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，測(cè)得各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性物無(wú)明顯變化。細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，8、1.6μg/mL蛇蛻溶液能促進(jìn)該細(xì)胞的分裂增殖（圖3）。

3 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比酸、堿、氧化還原二步法水解蛇蛻；氧化還原法的提取效率最高，酸解蛇蛻的效率高于堿水解，水解后產(chǎn)物為分子量月1kDa的小肽。本實(shí)驗(yàn)比較不同濃度和溫度下的酸解效果，證實(shí)溫度、濃度均對(duì)酸解效果有很大的影響。這一結(jié)果與林琳[7]、許慶陵[8]等人的研究結(jié)果相似，而堿水解似乎更多的受溫度影響。此外，本研究中還優(yōu)化了氧化還原法水解蛇蛻中過硫酸鉀的濃度。

目前，膠原蛋白在很多領(lǐng)域都有重要的作用，如可以通過注射增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)體外成骨的作用[9]，促進(jìn)鼠坐骨神經(jīng)的再生[10]，嵌入軟骨細(xì)胞的膠原蛋白凝膠可以修復(fù)軟骨的缺陷[11]，在體外膠原蛋白能夠促進(jìn)上皮、內(nèi)皮和角膜細(xì)胞的增殖[12]。本研究中獲得的蛇蛻多肽也有促進(jìn)細(xì)胞增殖的生物活性。相信伴隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，膠原蛋白的生物學(xué)功能將進(jìn)一步被開發(fā)利用，膠原蛋白的提取工藝也將會(huì)不斷的優(yōu)化和利用。

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