異丁醇萃取三種酶解產物苦味肽的研究

楊昭，姚玉靜*，黃佳佳，韓晉輝，梁志理，崔春

(1.廣東食品藥品職業學院 食品學院，廣州 510520；2.廣東食品藥品職業學院實驗實訓中心，廣州 510520；3.華南理工大學 輕工與食品學院, 廣州 510640)

蛋白質酶解產物富含小肽和氨基酸，具有鮮味突出、口感飽滿、風味濃郁、營養豐富、生物效價高的特征，是制備風味調味品、調味料、呈味基料、營養液的重要原料[1-3]。為獲得高質量的酶解產物，通常將蛋白質通過酶充分水解。但水解度高的蛋白質酶解產物具有苦味，其成因主要是含有苦味肽成分[4]。酶解產物的苦味制約了其在食品和保健品工業領域中的應用[5]。目前降低或脫除酶解產物苦味肽的方法，主要包括選擇性分離、化學成分掩蓋、微生物端化酶處理、美拉德反應等[6]。然而也有研究表明苦味肽具有一定的生物活性，如具有ACE 抑制活性的as1酪蛋白1～9片斷[7]。因此，將苦味肽選擇分離并進行結構鑒定是探究其脫除機制和其生物活性應用的重要前提。

目前分離苦味肽的方法主要有大孔樹脂、超濾、納濾、有機試劑萃取、凝膠色譜、離子交換色譜、電泳等[8-10]。其中有機試劑萃取法為快速大規模分離苦味肽的良好方法，可以避免其他方法耗時長、耗費大、操作繁瑣、分離肽種類少等缺點。有機試劑萃取法常用的溶劑為異丁醇、氯仿、甲醇、乙醇、丙醇等，其中用異丁醇萃取的方法較多。Lalasidis等[11]最早研究發現異丁醇能有效萃取出酶解產物中的苦味肽。周俊清等[12]也發現用50%異丁醇可完全萃取出酪蛋白酶解產物中的苦味肽。牡蠣、雞肉和南極磷蝦富含蛋白質，為重要的蛋白質資源，其酶解產物具有較高的營養價值和商業價值。在研究其酶解過程中發現，隨著水解度的增大，酶解產物具有苦味。為探究酶解過程中苦味肽的產生機理及其生物活性，需要對苦味肽進行快速分離。目前未有文獻報道采用異丁醇萃取牡蠣、雞肉、南極磷蝦酶解產物中的苦味肽。

本研究以牡蠣、雞肉和南極磷蝦為原料，采用胰蛋白酶和風味蛋白酶組成復合蛋白酶酶解原料，通過異丁醇萃取酶解產物中的苦味肽，探究異丁醇萃取苦味肽過程中感官和肽分子量分布的變化，以期尋找一種快速分離3種酶解產物中苦味肽的方法，為牡蠣、雞肉和南極磷蝦酶解產物中苦味肽的脫除及其生物活性的研究提供理論與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮近江牡蠣：購于廣州黃沙水產市場，開殼，取肉，清洗，攪碎均勻后分裝于封口袋中，-18 ℃凍藏備用；新鮮清遠雞肉：購于廣州龍洞上社市場，取雞胸肉攪碎均勻后分裝于封口袋中，-18 ℃凍藏備用；南極磷蝦：由青島東風遠洋漁業有限公司提供，攪碎均勻后分裝于封口袋中，-18 ℃凍藏備用。

胰蛋白酶(酶活 4000 U/g)：購于重慶市全新祥盛生物制藥有限公司；風味蛋白酶(酶活 500 LAPU/g)：諾維信中國公司；維生素B12(MW 1855 U)、抑肽酶(MW 6512 U)、細胞色素C(MW 12384 U)、卵清蛋白(MW 43000 U)：美國Sigma公司；食用鹽、味精、蔗糖、檸檬酸：食品級；其他試劑：均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜 日本島津制作所；S220 酸度計、TLE104E分析天平 梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；K9840凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司；3K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；DKZ-3B水浴振蕩培養箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶解產物制備

凍藏原料置于室溫溶解后，根據原料的質量按照1∶1的比例加入相應重量的蒸餾水，攪拌均勻，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.0(酶解過程中每隔2 h調1次pH，確保pH維持在7.0)，添加牡蠣重量0.4%的胰蛋白酶和0.2%的風味蛋白酶，在溫度為55 ℃的水浴條件下酶解20 h。酶解結束后沸水浴20 min滅酶，8000 r/min離心20 min，取上清液即為酶解產物，-18 ℃凍存備用。

1.3.2 異丁醇萃取苦味肽

參照文獻[13,14]，取50 mL酶解產物，冷凍干燥至粘稠狀，加入50 mL 80%乙醇，室溫狀態下攪拌萃取30 min，然后離心(8000 r/min，10 min)收集醇溶部分。通過旋轉蒸發去除乙醇，濃縮物用10 mL蒸餾水復溶，溶液冷凍干燥后即為80%乙醇萃取物，-18 ℃凍藏備用。取2 g 80%乙醇萃取物用50 mL蒸餾水溶解，再加入50 mL 異丁醇，室溫狀態下攪拌萃取10 min，轉移至分液漏斗中靜置，待液體分成清晰的兩層后，將下層萃取相通過漏斗下口放出，通過55 ℃旋轉蒸發濃縮后，用10 mL蒸餾水復溶即為異丁醇萃取乙醇相下清液。上層萃取物從漏斗口倒出，通過55 ℃旋轉蒸發濃縮后，用10 mL蒸餾水復溶即為異丁醇萃取乙醇相上清液。

1.3.3 水解度測定

總氮含量根據GB 5009.5-2010測定。氨基酸態氮含量根據甲醛滴定法測定[15]。水解度(DH)按照下式進行計算：DH(%)=W1/W×100%，式中：W1為氨基酸態氮含量，g；W為原料總氮含量，g。

1.3.4 感官評定

根據文獻[16]，選取7名感官評定員在感官評價室進行感官評定。感官評定員在評定之前經過基本滋味培訓，進行培訓的標準品分別是酸味(0.04%檸檬酸)、甜味(1%蔗糖)、苦味(0.02 g/L鹽酸奎寧)、咸味(0.35%食用鹽)、鮮味(0.2%味精)。使用5點線性坐標，將標準品梯度稀釋，最高濃度為10分，最低濃度為2分，每稀釋1個梯度，感官分值降低2分。樣品配制為固形物濃度為10%的溶液，采用滋味特征描述與感官定量分析對樣品進行感官評定。評定步驟：評定員從低濃度至高濃度逐一品評某一滋味各稀釋梯度標準液并記錄滋味強度，標準液在口中停留15～20 s，之后吐掉，蒸餾水漱口，取5 mL測試樣液放于口中，樣液在口中停留15～20 s，之后吐掉，根據樣品與各稀釋梯度標準液滋味強度的相近性進行打分，同時用文字記錄樣品滋味特征。

1.3.5 肽分子量分布測定

根據文獻[17]，將樣品稀釋至蛋白濃度為1 mg/mL，通過0.22 μm濾膜過濾，使用高效液相色譜測定樣液中肽分子量分布情況，洗脫液為0.04 mol/L磷酸緩沖液，流速為 1 mL/min，檢測波長為220 nm，凝膠柱為TSk gel G2000 SWxL(300 mm×7.8 mm，5 μm)。標準肽樣品分別為：卵清蛋白(MW 43000 U)、細胞色素C(MW 12384 U)、抑肽酶(MW 6512 U)、維生素B12(MW 1855 U)。根據標準肽樣品的洗脫時間得到標準曲線方程：y=-0.3383x+7.3451(R2=0.9917)。

式中：y為分子量的對數，u；X為保留時間，min。

1.3.6 數據分析

所有的實驗均進行3次。統計分析采用Excel 2010軟件進行，數據采用平均數±標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 酶解產物水解度分析

圖1 酶解產物水解度Fig.1 Hydrolysis degrees of enzymatic hydrolysates

水解度是衡量蛋白質酶解程度的指標。水解度過低，蛋白質的空間結構未被破壞，疏水性基團不能與味蕾接觸產生苦味；水解程度過高，蛋白質完全被水解成為游離氨基酸，抑制了與苦味受體的結合，也不能產生苦味。因此，水解度對蛋白質酶解產物的苦味有重要影響[18]。為獲得富含小肽和游離氨基酸的酶解產物，盡可能將大分子蛋白質水解，采用水解效率高的胰蛋白酶和水解風味好的風味蛋白酶組成復合蛋白酶深度酶解原料。由圖1可知，復合蛋白酶分別酶解牡蠣、雞肉和南極磷蝦，均可達到較高的水解度，分別為51.77%，39.22%和50.54%。同樣的酶解條件下，牡蠣和南極磷蝦酶解產物的水解度非常接近，但高于雞肉。文志州[19]采用復合酶對新鮮牡蠣進行酶解，得到最大水解度為40.71%。張永生等[20]采用復合酶水解雞胸肉，得到最大水解度為20.04%。黃艷青等[21]采用木瓜蛋白酶水解南極磷蝦，得到最大水解度為44.24%。本試驗各原料酶解產物水解度均高于文獻所報道的。因此，可推斷酶解產物中含有豐富的小肽和游離氨基酸。

2.2 異丁醇萃取3種酶解產物苦味肽的滋味特性

酸、甜、苦、咸和鮮為人類的5種基本味覺，產生的機理是溶解于水或唾液中的呈味成分刺激味蕾，信號傳導至大腦皮層產生興奮或味覺[22]。苦味的產生主要是多肽片段中疏水性氨基酸與人體苦味受體相互作用的結果。人的感官評定是目前鑒定苦味肽最常用、有效和直觀的方法。因此通過感官分析，可為篩選苦味肽提供重要的依據。

表1 異丁醇萃取3種酶解產物苦味肽過程中組分的感官評定Table 1 Sensory evaluation of the components in the process of extracting 3 kinds of hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

圖2 異丁醇萃取牡蠣酶解產物苦味肽過程中組分滋味特性雷達圖Fig.2 Radar map of the components in the process of extracting oyster hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

圖3 異丁醇萃取雞肉酶解產物苦味肽過程中組分滋味特性雷達圖Fig.3 Radar map of the components in the process of extracting chicken hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

圖4 異丁醇萃取南極磷蝦酶解產物苦味肽過程中組分滋味特性雷達圖Fig.4 Radar map of the components in the process of extracting Antarctic krill hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

通過感官描述分析發現酶解產物與不同溶劑處理產物具有明顯不同的滋味。由表1和圖2可知，牡蠣酶解產物滋味復雜，具有鮮味和咸味，鮮味評分值為4.8分，咸味評分值為2.8分，苦味評分值較低，為2.0分。經過80%乙醇萃取后，上清液具有鮮、咸、酸味，鮮味評分值為6.4分，苦味評分值為0.8分。乙醇相再通過異丁醇萃取，上清液具有明顯苦味，苦味延遲性長，苦味評分值達到6.8分，與0.005 g/L鹽酸奎寧的苦味在感官上較一致。而下清液滋味平淡，具有微弱鮮味，苦味評分值為0.4分，基本無苦味。

由表1和圖3可知，雞肉酶解產物具有濃郁的雞肉風味，滋味厚重，鮮味明顯，具有良好滋味的鮮味和甜味評分值分別為8.3，4.0分，而苦味評分值為0分。這可能是由于較多的鮮味和甜味成分掩蓋了苦味。Kim等在研究中也發現韓國醬油中的鮮味成分能夠抑制人類苦味受體細胞的表達，可抑制苦味成分的苦味[23]。雞肉酶解產物經過80%乙醇萃取后，上清液具有微弱鮮味、酸味和苦澀味，鮮味、酸味、苦味評分值分別為4.6，3.3，1.4分。乙醇相通過異丁醇萃取后，上清液具有微弱的苦味，苦味評分值為4.4分，與0.0025 g/L鹽酸奎寧的苦味在感官上較一致；下清液滋味平淡，具有微弱的鮮味和咸味，苦味評分值為0.8分，基本無苦味。

由表1和圖4可知，南極磷蝦酶解產物具有濃郁的海鮮風味和明顯的鮮甜滋味，鮮味和甜味評分值分別為7.4，2.9分，苦味評分值為0.4分。經過80%乙醇萃取后，上清液具有較強鮮味和明顯的海鮮風味，鮮味評分值為6.5分，苦味評分值為0.3分。乙醇相通過異丁醇萃取后，上清液具有微弱苦味，苦味延遲性長，苦味評分值為5.0分，感官評判苦味值在0.0025～0.005 g/L鹽酸奎寧之間；下清液滋味平淡，具有極弱的鮮味。

由以上研究可看出異丁醇萃取3種酶解產物的上清液均具有一定的苦味，這與仲丁醇萃取鱈魚肉酶解液上清液具有明顯苦味值的結果一致。據此分析，異丁醇萃取物中含有大量疏水性的苦味肽。

2.3 異丁醇萃取3種酶解產物苦味肽的分子量分布

分子量分布是肽類產物的重要特征性指標，直接反映產物中不同大小分子量肽類的構成[24]。肽類的苦味與其相對分子量密切相關，分子量大于5 ku的肽無苦味，只有分子量小于5 ku的肽才可能會顯現出苦味，且分子量介于500～1000 ku的短肽苦味最強[25]。付光中等研究也發現蝦頭自溶產物的苦味主要來自分子量為3～5 ku的肽[26]。宋雪梅等采用液相色譜-串聯質譜從干酪中鑒定出的14種苦味肽均是分子量小于2 ku的肽[27]。

凝膠色譜是根據多肽分子的大小、形狀差異進行分離的一種方法。根據分子篩原理，分子量大的部分出峰時間早，保留時間短；分子量小的部分出峰時間晚，保留時間長。本試驗中經凝膠液相色譜分析后，標準肽樣品與出峰時間擬合直線方程為y=-0.3383x+7.3451，R2=0.9917，表明各標準肽樣品的相對分子量對數與洗脫時間呈現良好的相關性，可以準確地測定樣品中多肽的分子量分布。

圖5 異丁醇萃取牡蠣酶解產物苦味肽過程中組分的肽分子量分布Fig.5 Peptide molecular weight distribution of the components in the process of extracting oyster hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

注：M1為酶解產物;M2為80%乙醇萃取物;M3為異丁醇萃取乙醇相上清液;M4為異丁醇萃取乙醇相下清液。

譜圖按分子量大小連續分布，表明各組分為各種大小不等、長短不一的肽和氨基酸的混合物。由圖5可知，牡蠣酶解產物中多肽分子量分布主要集中在5 ku以下，比例為93%，其中小于1 ku的多肽占36.55%，1～3 ku的多肽占36.98%。經過80%乙醇萃取，上清液中小于5 ku的多肽比例為83.64%，其中小于1 ku的多肽占30.90%，1～3 ku的多肽占14.78%，3～5 ku的多肽占37.97%。乙醇相通過異丁醇萃取后，上清液中小于5 ku的多肽比例達到94.86%，其中小于1 ku的多肽占57.41%，1～3 ku的多肽占15.84% ，3～5 ku的多肽占21.62%；下清液中小于5 ku的多肽比例為77.67%，其中小于1 ku的多肽占24.23%，1～3 ku的多肽占13.12%，3～5 ku的多肽占40.32%。

圖6 異丁醇萃取雞肉酶解產物苦味肽過程中組分的肽分子量分布Fig.6 Peptide molecular weight distribution of the components in the process of extracting chicken hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

注：J1為酶解產物; J2為80%乙醇萃取物; J3為異丁醇萃取乙醇相上清液; J4為異丁醇萃取乙醇相下清液。

由圖6可知，雞肉酶解產物中多肽分子量分布小于5 ku的比例為75.28%，其中小于1 ku的多肽占24.16%，1～3 ku的多肽占25.23%，3～5 ku的多肽占25.60%。經過80%乙醇，上清液中小于5 ku的多肽比例為86.82%，其中小于1 ku的多肽占30.53%，1～3 ku的多肽占28.39%，3～5 ku的多肽占27.90%。乙醇相通過異丁醇萃取后，上清液中多肽分子量分布主要集中在5 ku以下，比例達到97.61%，其中小于1 ku的多肽占67.58%，1～3 ku的多肽占19.49%，3～5 ku的多肽占10.54%；下清液中小于5 ku的多肽比例為80.24%，其中小于1 ku的多肽占25.26%，1～3 ku的多肽占27.91%，3～5 ku的多肽占27.07%。

圖7 異丁醇萃取南極磷蝦酶解產物苦味肽過程中組分的肽分子量分布Fig.7 Peptide molecular weight distribution of the components in the process of extracting Antarctic krill hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

注：L1為酶解產物; L2為80%乙醇萃取物; L3為異丁醇萃取乙醇相上清液; L4為異丁醇萃取乙醇相下清液。

由圖7可知，南極磷蝦酶解產物中多肽分子量分布小于5 ku的比例為76.83%，其中小于1 ku的多肽占29.68%，1～3 ku的多肽占20.81%，3～5 ku的多肽占26.33%。經過80%乙醇萃取，上清液中小于5 ku的多肽比例為87.86%，其中小于1 ku的多肽占34.11%，1～3 ku的多肽占23.30%，3～5 ku的多肽占30.44%。乙醇相通過異丁醇萃取后，上清液中多肽分子量分布主要集中在5 ku以下，比例達到97.44%，其中小于1 ku的多肽占58.89%，1～3 ku的多肽占23.41%，3～5 ku的多肽占15.14%；下清液中小于5 ku的多肽比例為80.73%，其中小于1 ku的多肽占29.27%，1～3 ku的多肽占21.44%，3～5 ku的多肽占30.02%。

由以上結果分析可知，酶解產物通過80%乙醇萃取后可獲得豐富的多肽信息，上清液中多肽分子量分布均衡，各種分子量大小片段都存在。乙醇相再經過異丁醇萃取，上清液中主要是小于5 ku的多肽片段，3種酶解產物異丁醇萃取上清液均含有>94%的小于5 ku和>57%小于1 ku的多肽片段。

3 結論

采用復合蛋白酶深度酶解牡蠣、雞肉、南極磷蝦，獲得高水解度的酶解產物。通過80%乙醇分別萃取3種酶解產物，再通過異丁醇萃取乙醇相，萃取上清液可獲得豐富的苦味肽。異丁醇萃取牡蠣、雞肉和南極磷蝦乙醇相上清液感官評定都具有苦味，苦味評分值分別為6.8，4.4，5.0分。3種酶解產物異丁醇萃取乙醇相上清液均含有>94%的小于5 ku和>57%小于1 ku的多肽片段。本研究為快速萃取牡蠣、雞肉和南極磷蝦酶解產物中的苦味肽提供了新的方法，為后續苦味肽的質譜鑒定奠定了基礎。