MSI、PD—L1及IL—6在結直腸腺癌中的表達及意義

王超　鄭繪霞

【摘要】 目的：通過研究微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）、程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）及白介素6（interleukin 6，IL-6）在人結直腸腺癌組織中的表達，探討三者之間的相關性，分析其與結直腸腺癌臨床病理學參數間的關系。方法：用免疫組化法對312例結直腸腺癌組織及30例癌旁組織中錯配修復基因（Mismatch repair genes，MMRs）、PD-L1及IL-6的表達進行檢測，分析MSI、PD-L1、IL-6三者之間的相關性及各指標與結直腸腺癌臨床病理學參數間關系。結果：結直腸腺癌組織中，MSI表達率為16.3%，微衛星穩定（Microsatellite stability，MSS）表達率為83.7%。PD-L1及IL-6在結直腸腺癌組織中的陽性表達率與癌旁組織相比均明顯上調（P<0.01）。結直腸腺癌組織中，MSI與PD-L1蛋白表達呈正相關（P<0.01），MSI與IL-6蛋白、PD-L1與IL-6蛋白表達均呈負相關（P<0.01）。MSI表達與患者低齡（≤60歲）、升結腸、低分化、無淋巴結轉移相關，而PD-L1、IL-6表達僅與腫瘤分化程度相關。結論：結直腸腺癌組織中PD-L1和IL-6的表達均明顯上調，均與結直腸腺癌的分化程度相關，可能作為結直腸腺癌惡性程度的評價指標及臨床治療的靶點；PD-L1表達增高與MSI狀態及IL-6表達下調相關，通過檢測MSI及IL-6表達情況，可能預測抗PD-L1免疫治療的有效率，通過抑制腫瘤中IL-6的表達可能提高抗PD-L1治療的有效率；MSI更多表達于低年齡、升結腸、分化差及無淋巴結轉移患者，有利于免疫治療的初步分流。

【關鍵詞】 結直腸癌； PD-L1； IL-6； MSI

Expression and Significance of MSI，PD-L1 and IL-6 in Colorectal Adenocarcinoma/WANG Chao，ZHENG Huixia.//Medical Innovation of China，2018，15（26）：036-040

【Abstract】 Objective：To study the expression of microsatellite instability（MSI），programmed death ligand 1（PD-L1）and interleukin 6（IL-6） in human colorectal adenocarcinoma，to explore the correlation between them and the clinicopathological parameters of colorectal adenocarcinoma.Method：The expression of mismatch repair genes（MMRs），PD-L1 and IL-6 in 312 colorectal adenocarcinoma tissues and 30 adjacent tissues were detected by immunohistochemistry.Correlations of MSI，PD-L1 and IL-6，as well as the relationship between each index and clinicopathological parameters of colorectal adenocarcinoma was analyzed.Result：In colorectal adenocarcinoma，the MSI expression rate was 16.3%，and the microsatellite stability（MSS） expression rate was 83.7%.The positive rates of PD-L1 and IL-6 in colorectal adenocarcinoma were significantly higher than those in adjacent tissues（P<0.01）.In colorectal adenocarcinoma，MSI was positively correlated with PD-L1 protein expression（P<0.01）.MSI was negatively correlated with IL-6 protein expression， so was PD-L1 and IL-6 protein expression（P<0.01）.MSI expression was associated with younger age（≤60 years old），ascending colon，poorly differentiated，and no lymph node metastasis.The expression of PD-L1 and IL-6 was only related to the degree of tumor differentiation.Conclusion：The expression of PD-L1 and IL-6 in colorectal adenocarcinoma is significantly up-regulated，which is related to the differentiation of colorectal adenocarcinoma，and might be used as an index to evaluate the malignant degree of colorectal adenocarcinoma and as a target for clinical treatment.The increased expression of PD-L1 is associated with the down-regulation of MSI and IL-6 expression.By detecting the expression of MSI and IL-6，we could predict the effective rate of anti-PD-L1 immunotherapy，and increase the effective rate of anti-PD-L1 therapy by inhibiting the expression of IL-6 in tumor.The expression of MSI in patients with low age，ascending colon，poor differentiation and no lymph node metastasis is beneficial to the preliminary shunt of immunotherapy.

【Key words】 Colorectal cancer； PD-L1； IL-6； MSI

First-authors address：Basic Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.26.009

結直腸癌在我國具有較高的發病率及死亡率[1]，許多患者發現時已失去手術機會，免疫治療與化療和放療相比不良反應較輕[2]。微衛星又稱簡單重復序列，當錯配修復基因（Mismatch repair genes，MMRs）缺失時，則會導致微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）。程序性細胞死亡受體1（PD-1）與其配體PD-L1結合引起免疫逃逸[3]，通過阻斷PD-1/PD-L1可用于治療腫瘤，研究表明MSI型結直腸癌對抗PD-L1免疫治療反應良好[4-5]，但反應率非常低。IL-6是一種多效細胞因子，在MSI陽性腫瘤中低表達[6]，研究發現阻斷IL-6可能提高抗PD-L1治療的有效率。本文擬通過免疫組化法檢測結直腸腺癌中MMRs、PD-L1及IL-6的表達，探討結直腸腺癌中MSI、PD-L1及IL-6之間的相關性及各指標與結直腸腺癌臨床病理學參數的關系，以期為結直腸癌抗PD-L1免疫治療尋找一種新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集山西醫科大學第一臨床醫學院病理科2013年1月-2017年8月經外科手術切除的結直腸腺癌石蠟標本312例，30例癌旁組織作為對照。所有病例均為首發腫瘤，均有完整的臨床、病理資料，HE染色切片均經高年資病理醫師鏡下明確診斷，術前未行放化療等輔助治療，癌旁組織距癌灶邊緣10 cm以上（鏡下未見癌細胞）。312例患者中，男174例，女138例；年齡37～86歲，平均（65.32±8.68）歲，>60歲213例，≤60歲99例；發生部位：降結腸、直腸123例，升結腸189例；分化程度（WHO大腸腺癌組織學分級）：高、中、低分化者分別為54、173、85例；淋巴結轉移情況：有淋巴結轉移者142例，無淋巴結轉移者170例；臨床病理分期（AJCC TNM分期標準）：T1期+T2期171例，T3期+T4期141例。

1.2 方法

1.2.1 試劑 抗MLH1單克隆抗體、抗MSH2單克隆抗體、抗MSH6單克隆抗體、抗PMS2單克隆抗體、抗PD-L1單克隆抗體、抗IL-6單克隆抗體、免疫組化試劑盒和DAB試劑（中杉金橋試劑公司）。

1.2.2 實驗方法 按免疫組化試劑盒說明書進行。標本常規10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片脫蠟水化，3%H2O2清除內源性過氧化物酶活性，高壓熱修復，分別滴加鼠抗人MLH1單抗、兔抗人MSH2單抗、鼠抗人MSH6單抗、兔抗人PMS2單抗、鼠抗人PD-L1單抗、鼠抗人IL-6單抗，4 ℃過夜，復溫后滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡檢。PBS代替一抗作空白對照。

1.2.3 結果判定 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均表達于胞核，癌旁正常組織為內對照，癌組織中有一個細胞明顯著色即判為亞型陽性，至少一個亞型表達缺失判為MSI表達陽性，各亞型均表達判為MSS表達陽性。PD-L1表達于胞膜/胞質，以50%著色判為表達陽性；IL-6表達于胞膜/胞質，采用半定量積分判定：在40倍鏡下觀察著色強度：細胞未著色（0分）、淡黃色（1分）、棕黃色（2分）、棕褐色（3分）；在400倍鏡下判定陽性細胞百分比率：隨機觀察10個視野，陽性細胞百分比率為視野下陽性細胞數占所有瘤細胞的比值，取平均值，比值<5%（0分）、比值5%～25%（1分）、比值26%～50%（2分）、比值51%～75%（3分）、比值>75%（4分）[7]。將著色強度與陽性細胞百分率的得分相乘，得積為染色指數（SI）。SI>4為陽性表達，≤4為陰性表達。判定過程由2名經驗豐富的病理醫生負責。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0進行統計分析，計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗和Fisher確切概率法進行分析，兩兩指標表達相關性用Spearman相關檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMRs、PD-L1及IL-6在結直腸腺癌及癌旁組織中的表達 結直腸腺癌組織中MSI表達率為16.3%（51/312），MSS表達率為83.7%（261/312），癌旁組織中MSI表達率為0，MSS表達率為100%（30/30）。PD-L1及IL-6在結直腸腺癌組織中的陽性表達率分別為19.9%（62/312）、79.5%（248/312），PD-L1及IL-6在癌旁組織中的陽性表達率分別為3.3%（1/30）、23.3%（7/30），比較差異均有統計學意義（字2=14.19、69.81，P<0.01）。MSI型結直腸癌患者中，PD-L1、IL-6的陽性表達率分別為90.2%（46/51）、2.0%（1/51）；MSS型結直腸癌患者中，PD-L1、IL-6的陽性表達率分別為1.9%（5/261）、94.6%（247/261）。見圖1～3。

2.2 MSI、MSS、PD-L1及IL-6表達的相關性 312例結直腸腺癌組織中，MSI陽性表達51例，PD-L1陽性表達62例，MSI與PD-L1共同陽性例數為46例，共同陰性例數為245例，Spearman相關性分析顯示MSI與PD-L1蛋白表達呈正相關（r=0.78，P<0.01），見表1。IL-6陽性表達248例，MSI與IL-6共同陽性例數為1例，共同陰性例數為14例，Spearman相關性分析顯示MSI與IL-6蛋白表達呈負相關（r=-0.85，P<0.01），見表2。PD-L1與IL-6共同陽性例數為2例，共同陰性例數為4例，Spearman相關性分析顯示PD-L1與IL-6蛋白表達呈負相關關系（r=-0.93，P<0.01），見表3。

2.3 MSI、PD-L1與IL-6與結直腸腺癌臨床病理學參數之間的關系 （1）MSI在>60歲年齡組中的陽性表達率顯著低于≤60歲年齡組（字2=9.21，P=0.004）；MSI在升結腸的陽性表達率顯著高于降結腸、直腸（字2=9.08，P=0.004）；MSI在低分化組中陽性表達率明顯高于高、中分化組（字2=47.87，P<0.01）；MSI在有淋巴結轉移組中的陽性表達率顯著低于無淋巴結轉移組（字2=7.45，P=0.007）。MSI在結直腸腺癌中的表達與患者性別、腫瘤浸潤程度差異無統計學意義（P>0.05）。（2）PD-L1在低分化組中的陽性表達率明顯高于高、中分化組，差異有統計學意義（字2=71.92，P<0.01）。PD-L1在結直腸腺癌中的表達與患者年齡、性別、發生部位、淋巴結轉移與否、腫瘤浸潤程度均無關（P>0.05）。（3）IL-6在低分化組中的陽性表達率低于高、中分化組，差異有統計學意義（字2=179.21，P<0.01）。IL-6在結直腸腺癌中的表達與患者年齡、性別、發生部位、淋巴結浸潤與否、腫瘤浸潤程度均無關（P>0.05）。見表4。

3 討論

近幾年，結直腸癌發病率遞增，預后較差[8]，傳統的手術、放化療等治療具有其局限性，免疫治療近年來備受推崇[9]。正常機體可將生長中的腫瘤進行免疫系統清除，但腫瘤可發生免疫逃逸。PD-L1和PD-1近年來作為癌癥治療的潛在目標受到密切的關注[10]，越來越多研究發現MSI型結直腸癌對抗PD-L1劑派姆單抗治療有效[11]。然而結直腸癌對PD-1或PD-L1阻斷的反應率非常低[12]，且部分PD-L1陽性腫瘤患者對PD-L1/PD-1阻斷無效[13]。有研究發現IL-6水平可能影響結直腸癌對PD-L1治療的反應[14]。本研究通過免疫組化法檢測結直腸腺癌組織及癌旁組織中MMRs、PD-L1及IL-6的表達，分析了PD-L1、IL-6、MSI三者之間的相關性及其與結直腸腺癌臨床病理學參數間關系，以期為結直腸癌的抗免疫治療水平的提高尋求一種較新思路或治療策略。

本研究發現，與癌旁組織相比，結直腸腺癌組織中PD-L1、IL-6表達均明顯升高，與文獻[15]報道一致，提示PD-L1、IL-6的高表達可能與結直腸腺癌的發生發展有關。MSI狀態下PD-L1表達增高且IL-6表達下降，提示三者之間可能存在某種關聯，進一步探索三者之間的相關性可能為提高臨床免疫治療找到一種新路徑。于是進一步分析了MSI、PD-L1及IL-6三者之間的相關性，發現結直腸腺癌組織中，MSI與PD-L1蛋白表達呈正相關，MSI、PD-L1均與IL-6蛋白表達呈負相關。這提示三者之間關系密切，PD-L1表達上調與MSI狀態及IL-6的表達下調相關，通過檢測MSI及IL-6狀態可能更有利于篩選出適于抗PD-L1免疫治療患者，同時也能解釋臨床上出現的部分PD-L1陽性患者對PD-L1抗體耐藥的情況，這種情況下可能患者腫瘤細胞IL-6表達上調，影響PD-L1抗體效果。同時，通過抑制腫瘤患者IL-6的表達有可能提高PD-L1抗體治療的敏感性及有效率，將三者結合對于結直腸腺癌免疫治療可能有較好的應用前景。在此基礎上進一步分析了MSI、PD-L1及IL-6與患者結直腸腺癌臨床病理學參數的相關性，發現MSI表達與患者低齡（≤60歲）、升結腸、低分化、無淋巴結轉移相關，與患者性別及腫瘤浸潤程度無關。PD-L1、IL-6表達僅與腫瘤分化程度相關，兩者的表達均與患者年齡、性別、發生部位、淋巴結轉移與否、腫瘤浸潤程度無關。以上結果提示MSI有特定的某些臨床特征，有利于免疫治療的初步分流及腫瘤惡性程度的評估；另外PD-L1及IL-6在腫瘤中的表達上調可能參與了結直腸腺癌的發生發展，兩者與腫瘤分化程度相關，在一定程度上提示了腫瘤的惡性程度，可能作為結直腸腺癌的有效預后標記物及臨床治療的靶點。

綜上所述，MSI及PD-L1、IL-6的表達上調均可能參與了結直腸癌的發生發展，三者之間具有一定聯系，目前此項研究尚少，需要更多研究數據及功能學的驗證。將三者結合研究用于臨床可能有利于提高結直腸癌的免疫治療有效率，改善目前免疫治療受益人群低的情況。本研究為探索結直腸癌的免疫治療提供了一種新的可能，IL-6也有望作為一個新的靶點，用于結直腸腺癌的臨床治療。

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（收稿日期：2018-04-03） （本文編輯：張爽）