酸漿莖葉黃酮精制工藝及抗氧化活性研究

李 群孫明哲吳 威姜秀娟曹柏營

LI Qun1 SUN Ming-zhe1 WU Wei1 JIANG Xiu-juan2 CAO Bai-ying2

(1. 長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，吉林 長春 130033；2. 吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 長春 130052)

(1. Food and Biological Technology College, Changchun Vocational Institute of Technology, Changchun, Jilin 130033, China; 2. Food Engineering College, Jilin Engineering Normal University, Changchun, Jilin 130052, China)

酸漿(PhysalisalkekengiL.)屬多年生茄科植物，別名紅姑娘、燈籠草[1-3]。酸漿宿萼、全草、果實(shí)均可入藥，具有清熱解毒、化痰止咳的功效[4]，在《維吾爾醫(yī)常用藥材》中記載了成熟酸漿全草的抗炎、護(hù)肝和利尿等功效[5]。酸漿莖葉中含有木犀草素、槲皮素和揮發(fā)油等化學(xué)成分[6-7]，木犀草素等黃酮類化合物在抗炎[8]、抗菌[9]、抗腫瘤[10]、抗病毒[11]等方面具有顯著的生理活性，因此，值得深入探究酸漿莖葉的功效成分及其作用機(jī)理。

目前關(guān)于酸漿宿萼黃酮提取、純化及生物活性研究的報(bào)道較多[12-14]，但酸漿莖葉黃酮的報(bào)道僅體現(xiàn)在黃酮含量方面[15]，關(guān)于酸漿莖葉黃酮的提取工藝優(yōu)化，精制及抗氧化活性方面未見報(bào)道。本研究擬以長白山野生酸漿莖葉為原料，提取酸漿莖葉黃酮，利用大孔樹脂進(jìn)行精制工藝優(yōu)化，并從體外和體內(nèi)評價(jià)酸漿莖葉黃酮的抗氧化活性，為酸漿資源的精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酸漿莖葉：采自長白山山區(qū)，自然晾干，試驗(yàn)前用烘箱(60～70 ℃)干燥后粉碎、過80目篩子備用；

SPF昆明小鼠[合格證號：SCXK(遼)2015-003]：遼寧長生生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑與儀器

ABTS[2，2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽]：分析純，美國Sigma公司；

XDA-1、D101、AB-8和X-5型大孔吸附樹脂：天津允開樹脂科技有限公司；

T-AOC(總抗氧化能力)、GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)檢測試劑盒：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；

亞硝酸鈉、氯化亞鐵、亞油酸、硫氰酸等：分析純；

紫外可見光分光光度計(jì)：UV-2102C型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

多功能粉碎機(jī)：CS-700Y型，永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；

分析天平：AL104型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE52-99型，上海亞榮生化儀器廠；

真空冷凍干燥機(jī)：ALPHA 1-4 LD PLUS型，德國Marin Christ 公司；

離心機(jī)：1-16型，德國Sigma公司；

全自動生化分析儀：BK-400 BIOBASE系列分立式，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司。

1.2 酸漿莖葉黃酮粗提取物的制備

以72%乙醇作為提取溶劑，按1∶28 (g/mL)料液比，在67 ℃的條件下提取酸漿莖葉3.8 h，過濾，減壓濃縮，冷凍干燥備用。

1.3 酸漿莖葉黃酮粗提取物的精制

1.3.1 吸附率與解吸率的計(jì)算 參照文獻(xiàn)[16]測定酸漿莖葉黃酮含量，分別按式(1)、(2)計(jì)算吸附率和洗脫率。

(1)

(2)

式中：

A——吸附率，%；

D——解吸率，%；

C0——粗提液中酸漿莖葉黃酮的含量，mg/g；

C1——大孔樹脂吸附后的酸漿莖葉黃酮含量，mg/g；

C2——洗脫后溶液中酸漿莖葉黃酮含量，mg/g。

1.3.2 大孔吸附樹脂的優(yōu)選 取5 g酸漿莖葉黃酮粗提取物凍干粉，用500 mL去離子水溶解完全，得到酸漿莖葉黃酮粗提液(黃酮含量0.52 mg/g)。再稱取XDA-1、D101、AB-8和X-5型大孔吸附樹脂各5 g，與50 mL酸漿莖葉黃酮粗提液置于三角瓶中，室溫震蕩24 h，過濾除去樹脂，測定濾液中酸漿莖葉黃酮含量，計(jì)算吸附率；取吸附飽和后的樹脂，以50 mL 70%的乙醇溶液，室溫震蕩12 h，測定酸漿莖葉黃酮含量，并計(jì)算洗脫率。

1.3.3 靜態(tài)吸附曲線 稱取AB-8型大孔樹脂5 g， 與50 mL 酸漿莖葉黃酮粗提液混合置于三角瓶中，室溫震蕩，每隔20 min測定酸漿莖葉黃酮的含量，并繪制吸附率—時(shí)間曲線。

1.3.4 吸附液體積的影響 稱取AB-8型大孔樹脂5 g，分別加入酸漿莖葉黃酮粗提液25，50，75，100，125，150 mL于三角瓶中，室溫震蕩12 h，測定濾液中酸漿莖葉黃酮含量，計(jì)算吸附率。

1.3.5 洗脫劑的優(yōu)化 配制濃度為10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%的乙醇溶液各50 mL，加入吸附飽和的AB-8樹脂5 g，室溫震蕩12 h后過濾，測定其中的酸漿莖葉黃酮含量，并計(jì)算洗脫率。

1.3.6 洗脫流速的優(yōu)化 預(yù)處理完畢后，將大孔樹脂裝于層析柱中(Φ6.0 cm × 80 cm)，平衡12 h，加入酸漿莖葉黃酮粗提液20 mL，待粗提液全部進(jìn)入樹脂層后，以70%乙醇進(jìn)行洗脫，調(diào)整洗脫流速分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL/min，洗脫完畢，合并洗脫液并測定酸漿莖葉黃酮含量，計(jì)算洗脫率。

1.4 酸漿莖葉黃酮體外抗氧化活性

(1) 對亞硝基離子的清除作用：參照文獻(xiàn)[17]。

(2) 對ABTS+·的清除作用：參照文獻(xiàn)[18]。

(3) 對亞油酸脂質(zhì)過氧化的抑制作用：參照文獻(xiàn)[19]。

(4) 總抗氧化能力(T-AOC)的測定：按照試劑盒說明書測定。

1.5 酸漿莖葉黃酮體內(nèi)抗氧化活性

1.5.1 動物分組及給藥 取18～22 g 的SPF昆明小鼠60只，適應(yīng)飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為5組，即對照組(生理鹽水)、抗壞血酸組(15 mg/kg·BW)、酸漿莖葉黃酮低劑量組/PSF-L(100 mg/kg·BW)、酸漿莖葉黃酮中劑量組/PSF-M(200 mg/kg·BW)和酸漿莖葉黃酮高劑量組/PSF-H(400 mg/kg·BW)。試驗(yàn)時(shí)間為5周，灌胃給藥，每周計(jì)量小鼠體重，按式(3)計(jì)算小鼠體重增量，最后一次給藥4 h后，摘除眼球并取血，分離血清(4 000 r/min，20 min)，最后放入-80 ℃冰箱中備用。采血完畢后處死小鼠，解剖并取胸腺、肝臟和脾臟，清洗干凈后吸干稱重，然后分別按式(4)～(6)計(jì)算小鼠的胸腺系數(shù)、肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)。

(3)

(4)

(5)

(6)

式中：

B——小鼠體重增量，%；

T——小鼠胸腺系數(shù)，%；

L——小鼠肝臟系數(shù)，%；

S——小鼠脾臟系數(shù)，%；

M1——小鼠初體重，g；

M2——小鼠終體重，g；

X——小鼠胸腺重量，g；

G——小鼠肝臟重量，g；

P——小鼠脾臟重量，g。

1.5.2 小鼠血清生化指標(biāo)測定 在4 ℃下解凍小鼠血清，按試劑盒操作說明測定血清T-AOC、GSH-Px、SOD和MDA含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酸漿莖葉黃酮的精制工藝優(yōu)化

2.1.1 大孔樹脂優(yōu)選 不同大孔吸附樹脂對酸漿莖葉黃酮的吸附率和洗脫率見圖1。由圖1可知，AB-8樹脂對酸漿莖葉黃酮的吸附率和洗脫率最高，分別達(dá)到86.25%和88.37%，明顯優(yōu)于其他樹脂。AB-8屬于弱極性樹脂，對酸漿莖葉黃酮中的酚羥基和糖甙鍵的結(jié)合能力較強(qiáng)，同時(shí)洗脫也比較容易，因此本試驗(yàn)選用AB-8樹脂精制酸漿莖葉黃酮粗提液。

不同大寫字母表示吸附率之間差異顯著；不同小寫字母表示洗脫率之間差異顯著(P<0.05)。

圖1 不同大孔樹脂對酸漿莖葉黃酮吸附率和洗脫率的影響

Figure 1 The adsorption and desorption of microporous adsorbent resins on PSF

2.1.2 靜態(tài)吸附曲線 AB-8樹脂對酸漿莖葉黃酮的吸附過程較緩慢，主要包含物理吸附和化學(xué)吸附，其吸附速率與時(shí)間的關(guān)系見圖2。由圖2可見，隨吸附時(shí)間的延長，酸漿莖葉黃酮的吸附率呈先增加后平緩的趨勢，超過200 min后，吸附率變化較小，吸附樹脂達(dá)到物理飽和狀態(tài)，此時(shí)吸附率可達(dá)82.25%，AB-8樹脂吸附酸漿莖葉黃酮屬于單分子吸附[20]，更加利于酸漿莖葉黃酮的洗脫。

2.1.3 吸附液體積的影響 由圖3可見，隨著酸漿莖葉黃酮粗提液吸附體積的增加，吸附率在15 BV 時(shí)達(dá)到最大值(84.89%)，之后吸附趨于下降狀態(tài)，在30 BV時(shí)吸附率降至81.85%，由于吸附液濃度過大造成樹脂堵塞，影響酸漿莖葉黃酮的吸附，導(dǎo)致吸附率降低。

圖2 靜態(tài)吸附速率曲線

不同字母表示吸附率差異顯著(P<0.05)

2.1.4 洗脫劑的優(yōu)化 由圖4可見，在乙醇濃度70%時(shí)達(dá)到最大值(82.68%)，此時(shí)吸附樹脂中的大部分酸漿莖葉黃酮都被洗脫出來，而后洗脫率隨乙醇濃度的增大而減小。乙醇濃度70%時(shí)，酸漿黃酮與洗脫溶劑間的締合作用力最強(qiáng)，能夠更多地從樹脂上解吸下來，乙醇濃度增大后，締合作用力減弱，解吸率降低。

2.1.5 洗脫流速的優(yōu)化 由圖5可見，洗脫流速在0.5～2.0 mL/min 時(shí)，洗脫率呈線性增大，在2.0 mL/min時(shí)，達(dá)到最大值(84.38%)，此后，洗脫流速繼續(xù)增加，但洗脫率減小。洗脫流速過低時(shí)，樹脂內(nèi)部的酸漿黃酮洗脫不夠充分，洗脫周期延長；而洗脫流速過大則導(dǎo)致部分黃酮未能及時(shí)被洗脫出來，同樣導(dǎo)致洗脫率降低。因此，綜合考慮，洗脫流速確定為2.0 mL/min。

不同字母表示洗脫率差異顯著(P<0.05)

不同字母表示洗脫率差異顯著(P<0.05)

2.2 酸漿莖葉黃酮體外抗氧化活性

圖6 酸漿莖葉黃酮的體外抗氧化活性

2.3 酸漿莖葉黃酮體內(nèi)抗氧化活性

2.3.1 酸漿莖葉黃酮對小鼠體質(zhì)指數(shù)的影響 酸漿莖葉黃酮對小鼠體質(zhì)指數(shù)的影響見表1。由表1可見，與對照組比較， 抗壞血酸組、酸漿莖葉黃酮低、中、高劑量組的體重增量和肝臟系數(shù)未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，表明酸漿莖葉黃酮的毒性較低，動物的臟器未發(fā)生明顯的病變及損傷；在不同劑量的酸漿莖葉黃酮組中，胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)都明顯高于對照組(P<0.05)，表明酸漿莖葉黃酮對小鼠的免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用，效果優(yōu)于抗壞血酸組(P<0.05)。酸漿莖葉黃酮表現(xiàn)出一定的免疫調(diào)節(jié)活性。

2.3.2 酸漿莖葉黃酮對小鼠血清生化指標(biāo)的影響 由表2可見，抗壞血酸組、酸漿莖葉黃酮低、中、高劑量組的T-AOC、GSH-Px和SOD水平明顯高于對照組(P<0.05)，且中、高劑量組均高于抗壞血酸組(P<0.01)；抗壞血酸組、酸漿莖葉黃酮各劑量組的MDA水平明顯低于對照組(P<0.01)，表明酸漿莖葉黃酮可顯著降低小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的含量。酸漿莖葉黃酮各劑量組都表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

表1 酸漿莖葉黃酮對小鼠體質(zhì)指數(shù)的影響?

? *表示P<0.05，**表示P<0.01(與對照組比較)；△表示P<0.05，△△表示P<0.01(與抗壞血酸組比較)。

表2 酸漿莖葉黃酮對小鼠血清生化指標(biāo)的影響?

? *表示P<0.05，**表示P<0.01(與對照組比較)；△表示P<0.05，△△表示P<0.01(與抗壞血酸組比較)。

酸漿莖葉黃酮表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外和體內(nèi)抗氧化活性，關(guān)于酸漿莖葉黃酮抗氧化活性的機(jī)制及其他生物活性將在后續(xù)研究中進(jìn)行探討。