白酒大曲產(chǎn)酯化酶犁頭霉的分離鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

孫曉璐王明躍張 源

SUN Xiao-lu1 WANG Ming-yue1 ZHANG Yuan2

(1. 阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 阜陽 236031； 2. 阜陽師范學(xué)院，安徽 阜陽 236037)

(1. Fuyang Vocational Technical College, Fuyang, Anhui 236031, China; 2. Fuyang Normal University, Fuyang, Anhui 236037, China)

酯酶(Esterase E.C.3.1.1.2)也被稱作羧基酯酶，在白酒行業(yè)中常稱為酯化酶或酯分解酶，是由一類具有酸、醇酯化功能的特定微生物發(fā)酵產(chǎn)生[1-2]。研究[3]表明，酯酶大量存在于酵母菌、霉菌及其他細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，既可以水解酯類也可以催化合成低級脂肪酸酯。白酒發(fā)酵大曲中含有大量的能夠產(chǎn)酯化酶的功能性菌(包含細(xì)菌、酵母菌、霉菌等)，其代謝產(chǎn)物是構(gòu)成白酒風(fēng)味的前提[4]。其中，霉菌作為一類白酒釀造過程中重要的產(chǎn)酯化酶菌之一，所產(chǎn)生的酯化酶能夠?qū)⒓核岷鸵掖即呋铣蔀闃?gòu)成白酒主體呈香物質(zhì)的己酸乙醇[5-6]。因此，近年來能夠催化酸、醇縮合的產(chǎn)酯化酶菌株逐漸成為釀酒行業(yè)的研究熱點(diǎn)[7]。眾多學(xué)者[8-9]分別通過篩選代謝產(chǎn)酯化酶活力較高的菌株，催化己酸乙酯的合成，并與己酸菌復(fù)合使用，極大地提高了己酸乙酯的合成效率，從而達(dá)到提高白酒品質(zhì)、縮短發(fā)酵周期的目的。針對酒體增香，國內(nèi)外研究較多的是紅曲菌酯化酶酯化生成己酸乙酯[10-12]，但是對于犁頭霉產(chǎn)酯化酶菌株的研究還未見報(bào)道。

目前，在白酒大曲中不同霉菌的鑒定大多采用基于ITS rDNA 的分子生物學(xué)方法。例如，Li[13]和Wang等[14]分別采用分子生物學(xué)方法從芝麻香型白酒大曲及濃香型白酒大曲中鑒定了高產(chǎn)酯化酶的Schlegelellasp和Absidiablakesleeana菌株；Li等[15]通過ITS rDNA基因序列分離鑒定了中國傳統(tǒng)醋大曲中的典型微生物。主要是因?yàn)樵擃惙椒ㄖ苯訉δ繕?biāo)菌種的DNA進(jìn)行提取，通過分析所提取的DNA種類，確定目標(biāo)菌群的種類，是目前分析微生物菌群中常用的分子生物學(xué)方法。并且隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，利用ITS rDNA基因序列對微生物進(jìn)行種屬鑒定已經(jīng)在不同領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

本研究首先用生理生化的方法對白酒中溫大曲中的菌株進(jìn)行初步篩選分離，篩選出能夠高產(chǎn)酯化酶的菌株，然后采用基于ITS rDNA基因的分子生物學(xué)方法對菌株進(jìn)行鑒定，并確定該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，在彌補(bǔ)白酒犁頭霉分離鑒定等相關(guān)研究空白的基礎(chǔ)上，優(yōu)化得到白酒大曲產(chǎn)酯化酶犁頭霉的發(fā)酵條件，以期為提高大曲中酯含量及提高優(yōu)質(zhì)酒率等領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：安徽金種子酒業(yè)有限公司；

SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、DNA Marker：生工生物工程(上海)股份有限公司；

DNA聚合酶、pMD19-T Vector：寶生物工程(大連)有限公司；

Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；

氯化鈉、葡萄糖、EDTA、CTAB、SDS等其他生化試劑：分析純，市售；

平板篩選培養(yǎng)基：按照牛肉膏3 g，蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂25 g，蒸餾水1 000 mL配制培養(yǎng)基，然后將3%的聚乙烯醇溶液和三丁酸甘油酯按照9∶1(體積比)混合均勻即為乳化液，最后將培養(yǎng)基與乳化液按照4∶1(體積比)混合均勻，121 ℃滅菌20 min；

種子培養(yǎng)基：瓊脂20 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，1/3 000的孟加拉紅溶液100 mL，蒸餾水1 000 mL，混合均勻后121 ℃滅菌20 min；

固體培養(yǎng)基：麩皮1 000 g，玉米粉100 g ，豆粕200 g，硫酸銨20 g，蒸餾水1 000 mL，混合均勻后121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器設(shè)備

電子精密天平：AY120型，北京賽多利斯天平有限公司；

滅菌鍋：TOMY-SX-700型，美國Tomy公司；

超凈工作臺：SW-CJ-IBU型，蘇州蘇凈集團(tuán)；

高速離心機(jī)：5418型，芬蘭Eppendorf公司；

pH計(jì)：Orion 3 STAR型，美國Thermo公司；

光學(xué)顯微鏡：Eclipse 80i型，日本Nikon公司；

多功能搖床：HYL-A型，太倉強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

PCR儀：PTC100TM型，美國Thermo公司；

高電流電泳儀：PowPacTM HC164-5052型，美國Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司；

全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀：JS-380C型，上海培清科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株初篩 將大曲原料磨碎過60目篩，稱取20 g大曲原料添加到裝有200 mL生理鹽水的無菌錐形瓶中，25 ℃浸泡1 h。3層紗布過濾收集濾液。分別將濾液按照梯度稀釋法稀釋為10-2～10-6個/mL的菌懸液。然后取0.2 mL不同梯度的菌懸液并均勻涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，每個稀釋梯度做3個平行，將涂布好的平板培養(yǎng)基置于35 ℃恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d。分別測定菌落周圍出現(xiàn)的透明圈(D)與菌落直徑(d)的比值。選擇D/d較大的菌株進(jìn)行編號，然后將其保藏于20%的甘油管中，于-20 ℃貯藏。

1.3.2 菌株復(fù)篩 將初選得到的菌株在平板上進(jìn)行活化后，制備成1×107個/mL的孢子懸液，然后取上述懸液1 mL于100 mL的種子培養(yǎng)基中，調(diào)整培養(yǎng)箱溫度為35 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)2 d。取2 mL涂布于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35 ℃培養(yǎng)3 d，取出后50 ℃烘干，然后測定其酯化酶活力。

1.3.3 酶活力測定

(2) 酯含量測定：采用皂化法[17]。

1.3.4 菌株鑒定方法

(1) 形態(tài)觀察：采用美藍(lán)染色液進(jìn)行染色，做壓片處理后于40×油鏡下觀察，記錄細(xì)胞形態(tài)特征、細(xì)胞大小、出芽情況。置于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行采集，得到相關(guān)霉菌形態(tài)圖像，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

(2) 基因組DNA的提取：按操作說明書，使用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行真菌基因組DNA的提取，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(3) ITS rDNA分子鑒定：使用通用引物5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′, 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′擴(kuò)增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和2，PCR反應(yīng)體系為25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，然后在72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓為100 V。將條帶采用 DNA 膠回收試劑盒(Omega)進(jìn)行切膠回收，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

(4) 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：將測得序列在Gen Bank 中用Blast程序進(jìn)行相似性分析，用ClustalX 1.8進(jìn)行多序列對比分析，利用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

(5) Biolog鑒定：挑選培養(yǎng)平板上的單個菌落，采用Biolog專用培養(yǎng)基將菌株進(jìn)行純化，配制一定細(xì)胞濃度的菌懸液，將菌懸液接種至特定鑒定板培養(yǎng)一定時間，經(jīng)Biolog微生物鑒定儀鑒定。

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1.3.5 菌株LD06的發(fā)酵條件確定

(1) 碳源選擇及最適添加量的確定：根據(jù)1.1中固體培養(yǎng)基的配制方法，分別以淀粉、玉米粉、果糖、葡萄糖、蔗糖作為碳源配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基，添加量為1 g，36 ℃培養(yǎng)4 d后測定酶活力，確定最佳碳源。然后選擇最佳碳源添加量為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g時，測定酶活力以確定最佳碳源添加量。

(2) 氮源選擇及最適添加量的影響：根據(jù)1.1中固體培養(yǎng)基的配制方法，分別以蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉、酵母粉、硫酸銨、豆粕粉為氮源配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基，添加量為1 g，36 ℃ 培養(yǎng)4 d后測定酶活力，確定最佳氮源。然后選擇最佳氮源添加量為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g時，測定酶活力以確定最佳氮源添加量。

(3) 其他組成的影響：根據(jù)1.1中固體培養(yǎng)基的配制方法，分別在確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳氮源、碳源及其添加量后，各添加大豆油1 g/100 g·培養(yǎng)基，Tween 80 1 g/100 g·培養(yǎng)基，亞麻籽油1 g/100 g·培養(yǎng)基，葵花籽油1 g/100 g·培養(yǎng)基，乙醇5 g/100 g·培養(yǎng)基，乳酸0.4 g/100 g·培養(yǎng)基，研究不同的添加物對酶活力的影響[16-17]。

(4) 發(fā)酵條件對菌株LD06產(chǎn)酶的影響：在確定固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上(麩皮10 g，玉米粉1.5 g、酵母粉2.0 g、亞麻籽油1 g/100 g·培養(yǎng)基、硫酸銨0.2 g、蒸餾水10 mL)，固定發(fā)酵溫度分別為32，36，40 ℃時，不同發(fā)酵時間36，39，42，45，48，51，54 h對菌株產(chǎn)酯化酶活力的影響。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理及作圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 8.2(SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，不同平均值之間利用Fisher’s 最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。所有試驗(yàn)都是隨機(jī)抽取3個重復(fù)(n=3)進(jìn)行指標(biāo)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酯化酶霉菌菌株的篩選

2.1.1 初篩結(jié)果 將試驗(yàn)大曲涂布后于35 ℃培養(yǎng)4 d，根據(jù)試驗(yàn)條件選取D/d相對較大的8株菌株，具體編號見表1。從表1中選取D/d較大的4個菌株進(jìn)行復(fù)篩。

表1 菌株初選結(jié)果?

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果 將4個菌株接種到種子培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)2 d后涂布于固體培養(yǎng)基上，35 ℃靜置培養(yǎng)3 d，分別測定不同菌株的酯化力，見表2。從表2可以看出，菌株LD06有最高的酯化力為7.605 g/L。因此，選用該菌株進(jìn)行后續(xù)的研究。

2.2 高產(chǎn)酯化酶菌株LD06的形態(tài)特征及生理生化鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征 將菌株LD06在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，菌絲呈白色長毛狀，不產(chǎn)色素，具有典型的霉菌菌落特征，見圖1(a)。通過在顯微鏡下觀察可以看出[圖1(b)]，菌株LD06菌絲存在較多的分支、無匍匐菌絲和假根、具隔、頂端膨大形成圓形的孢子囊。

表2 菌株復(fù)篩結(jié)果?

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖1 LDO6菌株的菌落形態(tài)

2.2.2 高產(chǎn)酯化酶LD06菌株基于16S rDNA基因的分子生物學(xué)鑒定 從圖2可以看出，菌株ITS rDNA基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物約為600 bp的單一DNA條帶，與引物設(shè)計(jì)的目標(biāo)片段大小相符。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶，連接到pMD19-T載體上進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，擴(kuò)增片段長度為666 bp個堿基序列。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量 1. rDNA

將菌株LD06的ITS rDNA基因序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，選取與菌株LD06 ITS rDNA基因同源性較高的菌株的ITS rDNA序列進(jìn)行比對，利用DNAMAN構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示，菌株LD06與Lichtheimiaramosastrain(KY072930.1)、LichtheimiacorymbiferastrainF49(KF278648.1)相似度均為99%。因此，根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物綜合分析初步鑒定菌株LD06是Lichtheimiacorymbifera或Lichtheimiaramosa。

圖3 基于ITS rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.3 高產(chǎn)酯化酶LD06菌株Biolog鑒定 Biolog鑒定方法是一種新型微生物鑒定方法，目前已廣泛應(yīng)用于大曲、窖泥等微生物的分離、純化、鑒定。本研究將LD06通過Biolog微生物鑒定儀鑒定，具體見表3。從表3可以看出，菌株LD06為Absidiacorymbifera(Cohn)Saccardo(傘枝犁頭霉)。

表3 Biolog鑒定結(jié)果

2.3 菌株LD06的發(fā)酵條件

2.3.1 培養(yǎng)基組成對菌株LD06產(chǎn)酶的影響

(1) 碳源及添加量：從圖4(a)可以看出，淀粉和玉米粉作為碳源更適合于菌株LD06產(chǎn)酯化酶。比較2種碳源可以得出，玉米粉作為碳源時，LD06產(chǎn)酯化酶的能力最強(qiáng)，分析原因主要是該類碳源中可能含有其他諸如維生素、氨基酸等促生長因子。因此，研究中選用玉米粉作為LD06產(chǎn)酯化酶發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，不同的玉米粉添加量對菌株LD06產(chǎn)酯化酶的能力的影響結(jié)果見圖4(b)。當(dāng)玉米粉添加量低于1.5 g時，由于培養(yǎng)基中碳源添加量太低，影響了菌株的生長及產(chǎn)酯化酶；而當(dāng)玉米粉添加量超過1.5 g時，過量的碳源會極大地促進(jìn)菌株的生長，加速了菌體代謝及凋亡的速率，從而降低了酯化酶的產(chǎn)量。因此，當(dāng)玉米粉添加量為1.5 g時，能顯著提高菌株LD06產(chǎn)酯化酶的能力。

(2) 氮源及添加量：在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.5 g玉米粉作為碳源，氮源種類對LD06產(chǎn)酯化酶的影響結(jié)果見圖5(a)。從圖5(a)可以看出，酵母粉是菌株LD06產(chǎn)酯化酶發(fā)酵培養(yǎng)基中最合適的氮源，其次為黃豆粉和豆粕粉。

酵母粉添加量對LD06產(chǎn)酯化酶的影響作用見圖5(b)。從圖5(b)可以看出，酵母粉添加量對酯化力有顯著的(P<0.05)影響，表現(xiàn)為酵母粉添加量低于2.0 g/L時，酯化力顯著(P<0.05)增加，而當(dāng)酵母粉添加量超過2.0 g時，LD06產(chǎn)酯化酶顯著(P<0.05)降低。因此，選擇2.0 g的酵母粉作為菌株LD06產(chǎn)酯化酶發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

(3) 其他添加物：從圖6可以看出，與對照組相比，油脂類添加物能夠顯著(P<0.05)提高LD06產(chǎn)酯化酶的能力，但是表面活性劑(tween 80)、乙醇、乳酸對LD06產(chǎn)酯化酶的影響較小。主要是因?yàn)椋卺劸拼笄型ㄟ^添加油類物質(zhì)，可以促進(jìn)霉菌菌株的生長和產(chǎn)酶量。Hama等[19]研究表明，油脂類成分不但可以作為酯化反應(yīng)的產(chǎn)物，促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行；還可以通過與霉菌細(xì)胞膜的作用，影響細(xì)胞膜的通透性，表現(xiàn)為促進(jìn)酯化酶向細(xì)胞外分泌。因此，在后續(xù)的研究中采用1%亞麻籽油作為菌株LD06產(chǎn)酯化酶的發(fā)酵誘導(dǎo)物質(zhì)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3.2 發(fā)酵條件對菌株LD06產(chǎn)酶的影響 從圖7可以看出，36 ℃是菌株LD06的最適發(fā)酵溫度，過高或過低都會降低其產(chǎn)酯化酶的能力。另外，在不同的發(fā)酵溫度條件下，隨著發(fā)酵時間的延長，菌株LD06產(chǎn)酯化酶的能力呈先增加后降低趨勢。表現(xiàn)為當(dāng)發(fā)酵溫度為36 ℃、培養(yǎng)時間為36～45 h 時，隨著發(fā)酵時間的延長，微生物在體系中大量生長，大量的菌株LD06布滿培養(yǎng)基中，使酯化力顯著(P<0.05)增加至最高；當(dāng)發(fā)酵時間超過45 h并繼續(xù)增加時，酯化酶活力不斷降低，主要因?yàn)榕囵B(yǎng)時間過長會導(dǎo)致菌株的菌絲逐漸衰老，并且產(chǎn)生了大量的孢子，導(dǎo)致產(chǎn)酶量逐漸降低。因此，發(fā)酵溫度36 ℃、發(fā)酵時間45 h是菌株LD06發(fā)酵產(chǎn)酶的最適條件。

因此，綜合上述結(jié)果可以看出，菌株LD06產(chǎn)酯化酶的固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：麩皮(基質(zhì))10 g，玉米粉(碳源)1.5 g、酵母粉(氮源)2.0 g、亞麻籽油(誘導(dǎo)物)1 g/100 g·培養(yǎng)基、硫酸銨0.2 g、蒸餾水10 mL；發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度36 ℃、時間45 h。該條件下得到的酯化力為9.32 g/L，與初始酯化力相比提高了22.55%。

圖7 培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間對酯化酶活力的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以中溫大曲為原料，從中篩選能夠產(chǎn)酯化酶的發(fā)酵菌種并鑒定其種類，研究該菌株產(chǎn)酯化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件。通過形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定及Biolog鑒定結(jié)果確定該菌株為犁頭霉，進(jìn)一步證實(shí)了研究中采用菌株鑒定方法準(zhǔn)確可靠。另外，本研究以酯化力為目標(biāo)值，優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵培養(yǎng)條件，與初始酯化力相比提高了22.55%，與劉維英等[9]、滕巍等[16]對產(chǎn)酯化酶菌株發(fā)酵條件的研究結(jié)果相比存在差異，是對白酒大曲產(chǎn)酯化酶菌株相關(guān)研究的補(bǔ)充。

本研究僅涉及了犁頭霉的分離鑒定及其產(chǎn)最高酯化酶活力的發(fā)酵條件優(yōu)化，未涉及到該犁頭霉產(chǎn)酯化酶的結(jié)構(gòu)、作用條件等。因此，對該酯化酶的篩選及酶學(xué)特性等有待進(jìn)一步深入研究。