黃花蒿提取物對奶牛瘤胃發(fā)酵指標的影響

王麗芳，斯琴畢力格，敖長金

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黃花蒿提取物對奶牛瘤胃發(fā)酵指標的影響

王麗芳1，斯琴畢力格2，敖長金2

（1內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，呼和浩特 010031；2內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，呼和浩特 010018）

【目的】在奶牛日糧中添加菊科植物黃花蒿乙醇提取物，研究其對瘤胃中乙酸、丙酸、丁酸等發(fā)酵指標的影響，進一步探討其對CLA合成的溶纖維丁酸弧菌()和蛋白溶解梭菌()的影響，旨在闡明黃花蒿乙醇提取物對奶牛瘤胃發(fā)酵的作用，并從瘤胃層次探明其對牛奶中CLA合成的部分作用機制。【方法】選取15頭體重為(600±29)kg、胎次2-3、泌乳期(158±3)d及泌乳量(22.8±1.8)kg·d-1相近的荷斯坦奶牛為試驗動物，試驗牛統(tǒng)一管理，自由采食、自由飲水；每天飼喂2次、擠奶2次（早上4:30、下午16:30）。試驗采用完全隨機設(shè)計，分為3組，分別是對照組和2個試驗組，每組5頭牛。試驗1組黃花蒿乙醇提取物的添加量為96 g/（d·頭），試驗2組黃花蒿乙醇提取物的添加量為160 g/（d·頭）。試驗期40 d，前9 d為預(yù)飼期，10—40 d為正式期。【結(jié)果】奶牛日糧中添加黃花蒿乙醇提取物可以增加瘤胃中pH值，其中兩個試驗組pH值分別增加了2.63%和8.61%，但差異不顯著(＞0.05)；添加黃花蒿乙醇提取物均降低了瘤胃中VFA的含量，除異戊酸和戊酸低劑量黃花蒿乙醇提取物與對照組差異不顯著外，其余各組乙酸、丙酸、丁酸均與對照組差異顯著(＜0.05)。添加黃花蒿乙醇提取物均增加了瘤胃液相和瘤胃液混合物中的相對百分比，差異顯著(＜0.05)；降低了瘤胃固相中的相對百分比，差異不顯著(＞0.05)。添加黃花蒿乙醇提取物均降低了瘤胃液相和瘤胃固相中的相對百分比，差異顯著(＜0.05)，增加了瘤胃液混合物中的相對百分比，但是差異不顯著(＞0.05)。【結(jié)論】奶牛日糧中添加黃花蒿乙醇提取物影響瘤胃發(fā)酵，對瘤胃不同內(nèi)容物中和影響不同，總體趨勢是增加瘤胃中的相對百分比，降低瘤胃中的相對百分比，有利于調(diào)控CLA的生成。

黃花蒿乙醇提取物；奶牛；瘤胃；溶纖維丁酸弧菌；蛋白溶解梭菌

0 引言

【研究意義】共軛亞油酸（CLA）是一組含有共軛雙鍵的亞油酸（linoleic acid）的幾何異構(gòu)體和位置異構(gòu)體的總稱[1-2]，cis-9、trans-11-CLA被認為是CLA的最主要的活性形式，俗名瘤胃酸，占牛奶中總CLA的80%—90%[3]。CLA具有抗癌、抗糖尿病、減少脂肪沉積和動脈硬化、改變營養(yǎng)分配及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等生物學作用[4-8]。因此，增加乳中cis-9、trans-11-CLA含量成為動物營養(yǎng)學領(lǐng)域的研究熱點?！厩叭搜芯窟M展】國內(nèi)外很多學者對增加乳中CLA含量開展了大量研究。研究表明，奶牛日糧中分別添加富含亞油酸及亞麻酸的日糧及浸提的油料籽實和豆油可以增加牛奶中CLA含量[9]，添加魚油可以提高牛奶中CLA含量[10]，體外試驗表明，稀釋率、pH值及魚油和葵花油對CLA含量有顯著影響[11]，在體外試驗亞油酸C18:2存在的條件下，添加離子載體（尼日利亞菌素，莫能菌素和替曲那新）減少了亞油酸的完全氫化，增加了200%的cis-9，trans-11-CLA[12]，奶牛釆食含有菊科植物的牧草或其提取物可以增加牛奶和羊奶中CLA含量[13-16]?！颈狙芯壳腥朦c】多數(shù)研究主要集中于如何增加牛奶中CLA的含量，但是對于影響CLA合成的作用機制研究相對較少，特別是對于植物提取物調(diào)控牛奶中CLA含量的作用機制研究較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過在奶牛日糧中添加菊科植物黃花蒿乙醇提取物，研究其對瘤胃中影響CLA合成的溶纖維丁酸弧菌（）和蛋白溶解梭菌（）的影響，同時探討對奶牛瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸和pH值的影響，旨在從瘤胃層次探明黃花蒿乙醇提取物對牛奶中CLA合成的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2016年9月5日至10月15日在內(nèi)蒙古呼和浩特市賽罕區(qū)章蓋營牧場進行，試驗期40 d，前9 d為預(yù)飼期，10—40 d為正式期。

1.2 試驗材料

1.2.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理 選取15頭體重為（600±29）kg、胎次（2—3）、泌乳期（158±3）d及泌乳量（22.8±1.8）kg·d-1相近的荷斯坦奶牛為試驗動物。試驗牛統(tǒng)一管理，自由采食、自由飲水；每天飼喂2次、擠奶2次（早上4：30、下午4：30）。

1.2.2 試驗日糧 試驗所用精飼料和粗飼料均來自呼和浩特市賽罕區(qū)章蓋營牧場，粗飼料由苜蓿、羊草、玉米青貯和谷草組成，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2.3 黃花蒿乙醇提取物 黃花蒿乙醇提取物購于南京澤朗公司，提取工藝條件是：乙醇濃度55%，提取溫度95℃，提取2 h。GC-MS和LC-MS分析的黃花蒿乙醇提取物活性成分主要包括：倍半萜類35%、芳香族類29%、脂肪酸類6%、甾體類6%、三萜類6%、脂肪族類4%、生物堿類3%、酚類5%、雜環(huán)類2%、其他4%（GC-MS）；黃酮類和萜類（LC-MS）。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機設(shè)計，分為3組，分別是對照組和2個試驗組，每組5頭牛。試驗1組黃花蒿乙醇提取物的添加量為96 g/（d·頭），試驗2組黃花蒿乙醇提取物的添加量為160 g/（d·頭）[16]，每天飼喂兩次，飼喂時黃花蒿乙醇提取物先與200g精飼料混合均勻讓奶牛釆食完再飼喂TMR飼料。前9 d為預(yù)飼期，10—40 d為正式期，試驗期共40 d。

1.4 測定指標

溶纖維丁酸弧菌、蛋白溶解梭菌、瘤胃總菌Total bacteria、pH值、VFA。

正式試驗期最后一天，每組隨機選取3頭牛，通過口腔采集瘤胃液，4層紗布過濾后直接測pH值；過濾后的瘤胃液取5 ml加入預(yù)先裝有1 mL 25%偏磷的離心管中，搖勻，置于-20℃冰箱中冷凍保存待測VFA；分別取過濾后的瘤胃液相、瘤胃固相及瘤胃液全混合物分裝于5 mL凍存管，所有樣品置于液氮中冷凍保存?zhèn)錅y3種細菌。

1.4.1 細菌基因組DNA的提取 DNA提取參照QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒說明書操作。并利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的細菌基因組DNA的質(zhì)量。

1.4.2 標準質(zhì)粒的制備 分別采用這3種細菌的特異性引物，同時以瘤胃內(nèi)容物基因組DNA為模板，PCR擴增其特異性片段，利用膠回收試劑盒（AXYGEN，USA）回收產(chǎn)物，并連接pMD18-T載體（Takara，Japan），轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞。菌落PCR鑒定陽性克隆子測序鑒定。根據(jù)測序結(jié)果，利用質(zhì)粒提取試劑盒（AXYGEN，USA）提取含有目的片段的標準質(zhì)粒，并利用Qubit 3.0（Invitrogen，USA）測定質(zhì)粒DNA溶液濃度，計算標準質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

1.4.3 標準曲線的制備 把標準質(zhì)粒DNA進行10倍梯度系列稀釋制作標準樣品和待測樣品一起擴增，得出標準曲線，根據(jù)所得標準曲線計算出樣品中的基因拷貝數(shù)，最后以基因拷貝數(shù)每μL為單位進行分析。

1.4.4 熒光定量 本研究通過熒光定量的方法對3種菌的基因進行定量?；蛞镄蛄幸姳?，引物濃度均為10 mmol·L-1。qPCR反應(yīng)在專用的PCR八連管（Axygen, USA）中進行，25 μL體系，反應(yīng)體系見表3。所有樣品做3個重復(fù)，使用Takara試劑盒。RT-PCR 的反應(yīng)程序為：95℃變性10 min，在95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次，熒光數(shù)據(jù)采集在延伸時進行。實時定量PCR在FTC-3000熒光定量PCR儀中進行。

表2 瘤胃氫化菌PCR的引物序列

F和R分別代表上、下游引物 F and R indicates forward and reverse primers, respectively

表3 PCR體系

1.4.5的計算（%）=/ Total bacteria×100%；

的計算：（%）=/ Total bacteria×100%。

1.4.6 VFA測定 參照文獻[17]方法測定VFA含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel2007初步整理后，采用SAS 9.2進行方差分析（ANOVA），采用DUNCAN法進行多重比較，＜0.05 作為差異顯著的判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 對瘤胃pH值和VFA的影響

從表4可以看出，與對照組相比，奶牛日糧中添加黃花蒿乙醇提取物可以增加瘤胃中pH值，其中兩個試驗組pH值分別增加了2.63%和8.61%，但差異不顯著（＞0.05）；添加黃花蒿乙醇提取物均降低了瘤胃中VFA的含量，除異戊酸和戊酸低劑量黃花蒿乙醇提取物與對照組差異不顯著外，其余各組VFA均與對照組差異顯著（＜0.05）。其中兩個試驗組乙酸含量分別降低了36.27%和57.25%，丙酸含量分別降低了28.01%和45.81%，丁酸含量分別降低了17.86%和42.86%，異戊酸含量分別降低了23.35%和52.10%，戊酸含量分別降低了5%和50%，且VFA降低與黃花蒿乙醇提取物添加量呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.2 對瘤胃中溶纖維丁酸弧菌的影響

從表5可以看出，與對照組相比，奶牛日糧中添加黃花蒿乙醇提取物均增加了瘤胃液相和瘤胃液混合物中的相對百分比，兩個試驗組分別增加了瘤胃液相中37.04%和40.74%，增加了瘤胃液混合物中83.3%和55.56%，差異顯著（＜0.05）；降低了瘤胃固相中的相對百分比，與對照組相比，兩個試驗組的相對百分比分別降低了12.5%和18.75%，但是差異不顯著（＞0.05）。

表4 黃花蒿乙醇提取物對瘤胃內(nèi)pH值和VFA的影響

同行數(shù)據(jù)不同小寫字母a,b,c表示差異顯著（＜0.05）。下同

In the same row, values with different small letter(a,b,c) mean significant difference(＜0.05). The same as below

表5 黃花蒿乙醇提取物對瘤胃溶纖維丁酸弧菌的影響

2.3 對瘤胃中蛋白溶解梭菌的影響

從表6可以看出，與對照組相比，奶牛日糧中添加黃花蒿乙醇提取物均降低了瘤胃液相和瘤胃固相中的相對百分比，兩個試驗組分別降低了瘤胃液相中5.03%和1.12%，降低了瘤胃固相中22.69%和4.20%，差異顯著（＜0.05）；增加了瘤胃液混合物中的相對百分比，與對照組相比，兩個試驗組的相對百分比分別增加了54.49%和16.67%，其中試驗1組顯著高于對照組（＜0.05），試驗2組與對照組差異不顯著（＞0.05）。

表6 黃花蒿乙醇提取物對瘤胃蛋白溶解梭菌的影響

3 討論

3.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

VFA是瘤胃發(fā)酵的主要指標之一，是碳水化合物在瘤胃中發(fā)酵的主要產(chǎn)物，可提供反芻動物總能量需要的70%—80%，且VFA含量與反芻動物能量轉(zhuǎn)化效率呈正相關(guān)，與pH值呈負相關(guān)。本試驗結(jié)果表明，添加黃花蒿乙醇提取物顯著降低了瘤胃中VFA的含量，增加了pH值，提示黃花蒿乙醇提取物可能會影響能量轉(zhuǎn)化效率，影響瘤胃發(fā)酵。

本研究結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果不完全一致。BAYAT等[18-19]研究報道，奶牛日糧中添加薺藍油、活酵母、肉豆蔻酸、菜籽油、紅花油和亞麻油對瘤胃pH值和VFA沒有顯著影響；而本試驗顯著降低了瘤胃中VFA的含量，增加了pH值，導(dǎo)致這種差異的可能是因為添加物不同所致，本試驗添加的是植物提取物，而上述研究中添加的是植物油等。本試驗也與一些試驗結(jié)果相同，王麗芳[16]研究結(jié)果表明，在奶山羊日糧中添加不同劑量的黃花蒿乙醇提取物均降低了瘤胃中乙酸、丙酸、丁酸等VFA各采樣時間點的平均濃度，增加了pH平均值，與本試驗結(jié)果一致，說明黃花蒿乙醇提取物對不同奶畜瘤胃發(fā)酵的影響相似。

3.2 瘤胃中B. fibrisolvens和C. proteoclasticum

反芻動物產(chǎn)品中 CLA 主要來源于兩個途徑，分別是外源途徑和內(nèi)源途徑，外源途徑就是亞油酸在瘤胃等分泌的異構(gòu)化酶作用下，異構(gòu)化為cis-9，trans-11-CLA，內(nèi)源途徑就是瘤胃不飽和脂肪酸生物氫化形成的中間產(chǎn)物反式油酸（trans-11-18：1，TVA）進入乳腺中，在△9-去飽和酶的作用下生成 CLA[20]，可以把TVA轉(zhuǎn)化為C18:0飽和脂肪酸[21]，近來，被歸類為，在現(xiàn)在的研究中，進一步被歸類為[22]。可以看出，對 cis-9，trans-11-CLA的生成具有正調(diào)控作用，而對cis-9，trans-11-CLA的生成具有負調(diào)控作用。因此通過營養(yǎng)調(diào)控措施，增加瘤胃中的含量，降低的含量有利于cis-9，trans-11-CLA的生成。

本試驗通過營養(yǎng)調(diào)控措施，對黃花蒿乙醇提取物調(diào)控cis-9，trans-11-CLA合成的兩種細菌和的研究結(jié)果表明，添加黃花蒿乙醇提取物可以增加瘤胃液相和瘤胃液全混合物中的相對百分比，降低了瘤胃固相中的相對百分比。茅慧玲[23]研究報道，添加低比例杭白菊莖葉增加了瘤胃液相中的含量，降低了瘤胃固相中的含量，與本試驗結(jié)果相一致；但是對于研究結(jié)果卻與本試驗結(jié)果不同，本試驗添加黃花蒿乙醇提取物降低了瘤胃液相和瘤胃固相中的相對百分比，但增加了瘤胃液全混合物中的相對百分比，而茅慧玲[23]研究表明，添加中比例杭白菊莖葉增加了瘤胃液相中的含量，但是對瘤胃固相中的含量沒有影響。導(dǎo)致這種差異的原因可能是這兩種植物所含的活性成分不完全相同所致，杭白菊莖葉的主要活性成分是黃酮類和揮發(fā)油類物質(zhì)[23]，而本試驗所用黃花蒿乙醇提取物的主要活性成分除黃酮類還包括萜類和芳香族類物質(zhì)。RAMOS- MORALES等[24]研究結(jié)果表明，大蒜精油中丙基丙硫代亞磺酸酯（PTS）顯著增加了瘤胃液中的豐度（＜0.05），降低了的豐度（＞0.05），與本試驗結(jié)果基本一致；RAMOS- MORALES等[25]通過體外試驗研究表明，添加0.02 g·L-1蓖麻酸對沒有影響，但降低了的含量，有助于CLA的積累，主要原因是蓖麻酸阻止了的生物氫化作用所致，與本試驗結(jié)果一致。

其他一些相關(guān)研究與本研究結(jié)果也存在異同點，周薇等[26]研究表明，添加α-亞麻酸在調(diào)控CLA生成的過程中，降低了瘤胃液中和的含量，且呈劑量依賴性，而本研究的結(jié)果添加黃花蒿乙醇提取物增加了瘤胃液中的含量，與上述研究結(jié)果不一致，但是降低的含量與上述研究結(jié)果相似，但是本研究這兩種菌與黃花蒿乙醇提取物沒有劑量效應(yīng)關(guān)系，與上述研究結(jié)果也不相符。劉仕軍等[27]研究表明，添加魚油和葵花油抑制了的生長，與本試驗結(jié)果不一致。史浩亭等[28]研究表明，添加蘇子油和橡膠籽油在高劑量（植物油添加量為飼料干物質(zhì)含量的3%和4%）時均降低了瘤胃液中的相對百分比。RAMOS-MORALES等[29]體外試驗研究表明，添加0.025 g·L-1斑鳩菊酸降低了的含量，添加0.05 g·L-1斑鳩菊酸降低了和的含量，與本試驗結(jié)果不完全相同。本試驗結(jié)果與以上結(jié)果不同的可能原因是添加物不同，本試驗添加的是植物提取物，而以上試驗添加的是植物油或脂肪酸。本試驗總體趨勢是增加瘤胃中的相對百分比，降低瘤胃中的相對百分比，有利于調(diào)控CLA的生成，本試驗結(jié)果與項目組在奶牛飼養(yǎng)試驗中增加牛奶中CLA含量的結(jié)果相一致[30]。

另外，目前對CLA合成的調(diào)控作用在瘤胃層次研究通常只選取瘤胃液相和固相，本研究對瘤胃液相、瘤胃固相和瘤胃液全混合物均進行了研究，結(jié)果表明，和在瘤胃不同內(nèi)容物中表達量不同，這提示在未來的研究中，選擇不同瘤胃內(nèi)容物，結(jié)果不相一致。

4 結(jié)論

奶牛日糧中添加黃花蒿乙醇提取物影響瘤胃發(fā)酵；對瘤胃不同內(nèi)容物中和影響不同，總體趨勢是增加瘤胃中的相對百分比，降低瘤胃中的相對百分比，有利于調(diào)控共軛亞油酸的生成。

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The Study on Effects ofExtracts on the Rumen Fermentation in Dairy Cows

WANG LiFang1, SIQINBILIGE2, AO ChangJin2

(1Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010031;2Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018)

【Objective】The effects of daisy plant () extracts (AAE) on the fermentation indexes such as acetic acid, propionic acid and butyric acid in the rumen in dairy cows were studied in this paper, and furthermore the effects onandfor regulating CLA synthesis in the rumen were researched. The purpose of this study was to explore the effects of AAE on rumen fermentation in dairy cows, and to investigate the part mechanism of effecting CLA synthesis from the rumen.【Method】Fifteen dairy cows (600±29) kg, parity 2-3, in lactating (158±3) d and milk yield (22.8±1.8)kg·d-1were used in completely random design in 40 d experimentalperiods. The experimental dairy cows were integrated management, free ingestion, free drinking water, feeding 2 times per day, milking 2 times (4:30 a.m., 16:30 p.m.). The experiments groups comprised the control and two treatments (treatment one and treatment two, the doses of AAE for supplementation was 96 g·d-1and 160 g·d-1for every cow, respectively). The experimental period comprised a 9-d adaptation and a 31-d the formal period. 【Recult】The results showed as follows: ruminal pH values tended to increase in two treatments for AAE supplementation compared with the control, which increased by 2.63% and 8.61%, respectively (＞0.05). The concentrations for acetic acid, propionic acid and butyric acid decreased significantly in two treatments except forisovaleric acid and valeric acid in the low dose of AAE compared with the control (＜0.05).AAE supplementation increased the relative percentage ofin rumen mixture and rumen liquid (＜0.05), and decreased the relative percentage ofin rumen solid (＞0.05). AAE supplementation decreased the relative percentage ofin rumen liquidand rumen solid(＜0.05), and increased the relative percentage ofin rumen mixture (＞0.05). 【Conclusion】It was concluded that AAE supplementation had adverse effect on rumen fermentation characteristics, and had different effects onandon different contents of the rumen, but the general trend was increasing the relative percentage of, and decreased the relative percentage of, which ws beneficial to CLA synthesis.

extracts; dairy cows; rumen;

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.23.013

2018-02-12；

2018-06-12

國家自然科學基金（31860663）、內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金（2013MS0418）、內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院青年創(chuàng)新基金（2014QNJJM02）

王麗芳，Tel：13848189461；E-mail：wanglifang100008@163.com

（責任編輯 林鑒非）